一种人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法技术

本发明专利技术公开了一种人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒，提供一种操作性强、临床安全性高、便于临床推广的人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法，所述试剂盒中包含以下四种试剂：A号液为稀释液；B号液为密度液；C号液为洗涤液；D号液为除红细胞液。本发明专利技术从根本上解决了现有细胞分离技术中存在的造价高、细胞活性低、标记物进入人体后对人体影响不明，需要注射动员剂造成患者痛苦，繁琐不适用临床等问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术书属生物医学技术应用领域。具体涉及一种体外分离人类骨髓、脐带血及外周血中干细胞的方法，特别是一种人类骨髓、脐带血、外周血干细胞处理试剂盒及细胞处理方法。
技术介绍
随着现在科学技术的不断发展，用于人类血液细胞的分离技术不断地发展和优化，目前的干细胞分离处理方法包括免疫磁珠法、流式细胞仪法、血细胞分离机法、培养扩增法及密度梯度离心法等，但是皆存在诸多的弊端。(1)免疫磁珠法通过包被在磁珠微粒上的抗体与细胞表面相应抗原阳性的细胞反应结合，然后通过磁性吸附原理将非吸附的细胞去除掉，收集被磁珠抗体吸附的细胞，此方法造价高，增加了患者的负担，不利于项目的推广和普及，而且对细胞活性有损伤，影响细胞疗效。(2)流式细胞仪法也是利用对目标细胞进行标记识别的原理通过流式细胞仪进行分选、收集。该方法存在筛选细胞范围小、细胞被标记后活性降低以及无法预知标记物在人体内的影响；而且该方法细胞污染风险高(3)血细胞分离机法只适用于从外周血中分离干细胞，应用受到限制；该方法需要给患者注射干细胞动员剂而增加治疗负担，同时分离后干细胞量小、液体体积大，对患者存在危险；(4)体外培养扩增法则需要对采集人类血液细胞进行培养，再清洗使用，此方法增加了污染风险，同时干细胞向未知方向分化为未知干细胞，培养时间长。目前基于密度梯度法的干细胞分离方法在临床上得到较广的应用。但是不同方法及操作步骤产生的效果不同，各有利弊，总体而言，存在如下几个问题：(1)不能标准化。比如申请号为200610035900.5的“一种干细胞分层液及其用于干细胞分离的方法”需要操作者自己配制工作液，而且需要调节比重，此方法增加了操作者的人为影响因素，不利于干细胞分离的推广和产业化。(2)红细胞去除不干净：比如申请号为200610035900.5的“一种干细胞分层液及其用于干细胞分离的方法”特别是对于脐带血来说，该专利方法除不净红细胞，最终临床应用的时候大大增加了患者产生排异反应的风险；申请号为200910187212.4的“人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法”也存在相同的缺点；(3)干细胞得率不高：比如申请号为200610114475.9的“用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒”，其缺点是分离的干细胞得率数量不高，需要进行细胞培养，但是由此增加了细胞污染率，同时体外细胞扩增所产生的细胞功能性不稳定，很难用于临床治疗；另外申请号为200610106875.5的“一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法”所采用的HISTOPAGUE077的密度1.077的淋巴细胞分离液，经分离后的细胞绝大多数为淋巴细胞，这样直接导致细胞中能够用于治疗的干细胞占少数，影响临床疗效；(4)分离纯化成本太高：比如申请号为200710137781.9的“骨髓脐带血干细胞体外分离试剂盒及其应用方法”的专利，其试剂中添加了lin抗体，导致成本大大提高，投入临床使用后，大大增加了患者的经济负担，导致患者看不起病，接受不起细胞治疗，并且使用了lin抗体对细胞清洗造成了较大负担，此种物质进入人体后对人体的影响还是个未知数，还有待进一步研究。(5)没有考虑蛋白沉淀、细胞凝聚因素对后期干细胞应用的风险：采用离心的方式分离纯化干细胞，在操作过程中往往由于脐血、外周血样品质量不同，干细胞在纯化过程中产生凝聚和沉淀，但此沉淀如果没有及时去除，在后期的应用过程中容易造成患者的微血管栓塞，影响治疗效果，严重者可危及患者的生命安全。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了提供一种操作性强、临床安全性高、便于临床推广的人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法，它从根本上解决了现有细胞分离技术中存在的造价高、细胞活性低、标记物进入人体后对人体影响不明，需要注射动员剂造成患者痛苦，繁琐不适用临床等问题。同时本试剂盒易于存储运输、可产业化、使用方便快捷。本专利技术的技术方案是：人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒，其技术要点是所述试剂盒中包含以下四种试剂：A号液为稀释液：PBS液；B号液为密度液：泛影酸钠-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077或Ficoll；泛影酸钠-聚蔗糖400#由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.075±0.001的密度液；C号液为洗涤液：0.9％氯化钠注射液；D号液为除红细胞液：0.8％氯化氨溶液；一种应用如权利要求1所述的人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法，其技术要点是：将含有枸橼酸钠抗凝剂的骨髓或脐带血或外周血按大于等于1∶1的比例加入A液，混匀；根据稀释好的样品体积，取适当数量的15ml离心管，先各装4ml的B液，再各取10ml稀释好的样品铺到B液上，然后以500-850g离心25分钟，分出干细胞层，收集干细胞层后用C液清洗细胞1次，用5-10ml的C液重悬细胞，加入约三倍体积的D液，混匀，反应6分钟，再以350-550g离心10分钟，去除上清，收集干细胞后用C液清洗细胞1-2次，根据需要再用70微米过滤器进行过滤，收集过滤后的干细胞后用C液清洗细胞1-2次，离心浓缩后用C液稀释到5-50毫升，待用。本专利技术的优点和积极的技术效果：(1)本专利技术能够分离人类骨髓或脐带血或外周血中的干细胞，即将试剂盒中4种试剂组合应用，通过B号试剂密度梯度离心，根据各种细胞密度差异将它们分散于自上而下的试剂层次，去除人类骨髓或人类脐带血或外周血中的血浆，血小板，血红蛋白，粒细胞和大部分红细胞等，经过本专利技术分离的干细胞回收率能够达到85％以上；(2)本专利技术通过将浓缩后的干细胞加入三倍体积的D号液进行反应，使红细胞破碎，再通过离心收集纯化的干细胞，达到去除红细胞的作用，避免了干细胞在后续的应用过程中患者产生排异反应的风险以及红细胞干扰；(3)本专利技术将纯化好的干细胞通过过滤器过滤，去除可能存在的沉淀杂质，通过本方法制备的干细胞，避免了后续干细胞应用过程中由于沉淀而引发的微血管栓塞危险。(4)本试剂盒包含分离纯化试剂盒的所有溶液，无需使用者另外准备溶液，简便使用者的使用准备工作，也避免使用者人为的污染或者第三方污染引入。(5)本专利技术适用于人类骨髓、脐带血、外周血的干细胞分离，对于不同的样品，试剂组成相同，避免了国内现有的一些专利只能分离人类骨髓和脐带血，不能分离外周血的问题。(6)本专利技术试剂原料便宜，配置过程简单、质量可控，不使用质量难以控制的生物制品，具有造价低，无任何标记物，保留原有细胞活性，细胞数量能够满足临床治疗的需要等优点。(7)本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法,其特征在于所述试剂盒中包含以下四种试剂：A号液为稀释液：PBS液；B号液为密度液：泛影酸钠？聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077或Ficoll；泛影酸钠？聚蔗糖400#由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.077±0.001的密度液；C号液为洗涤液：0.9％氯化钠液；D号液为红细胞裂解液：0.8％氯化氨溶液。

【技术特征摘要】
1.一种人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法,其特征在于所述试剂盒中包含以下四种试剂：
A号液为稀释液：PBS液；
B号液为密度液：泛影酸钠-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077或Ficoll；泛影酸钠-聚蔗糖400#由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.077±0.001的密度液；
C号液为洗涤液：0.9％氯化钠液；
D号液为红细胞裂解液：0.8％氯化氨溶液。
2.一种应用如权利要求1所述的人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
将含有枸橼酸钠抗凝剂的骨髓或脐带血或外周血按大于等于1∶1的比例加入A液，混匀；根据稀释好的样品体积，取适当数量的15ml离心管，先各装4ml的B液，再各取10ml稀释...

【专利技术属性】
技术研发人员：武栋成，
申请(专利权)人：武汉康苑生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：