一种用于治疗乳腺癌的药物及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种用于治疗乳腺癌的药物及其制备方法，所述药物为抗原冲击的DC与CIK的共培养物，通过将抗原冲击的DC与CIK进行共培养获得；所述用于治疗乳腺癌的药物，其中CIK细胞是来源于T淋巴细胞的具有免疫活性的异质细胞群，具有较强的抗肿瘤毒性，可以杀伤对化疗耐药的肿瘤细胞，是治疗多药耐药肿瘤的最具潜力的方法，DC细胞是最具潜力的抗原提呈细胞，可以识别、加工、提呈抗原给T细胞，是激发特异性免疫应答的中心和抗肿瘤免疫的重要载体，AP-DC+CIK的组合方式对于抑制肿瘤的生长、延长患者生存时间的效果突出；所述制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗肿瘤药物及其制备方法，尤其是。
技术介绍
·乳腺癌是女性排名第一的常见恶性肿瘤。2011年美国CA:A Cancer Journal forClinicians杂志(2010年影响因子94. 262)公布的最新统计数据显示，美国2011年预计将有230480例女性罹患乳腺癌，占女性新发恶性肿瘤的30%，排名女性恶性肿瘤发病率第一位。在我国北京、上海、天津等大城市的统计显示乳腺癌同样是我国女性最常见的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势。现有的乳腺癌治疗过程中对患者免疫系统的损害极大，导致肿瘤治疗过程中遇到无法突破的瓶颈，肿瘤无法完全治愈。现阶段细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells, CIK)是具有细胞毒作用的免疫活性细胞；树突状细胞(dendritic cell, DC)是最具潜力的抗原提呈细胞，在初始性免疫和获得性免疫中具有重要作用。因此将CIK联合DC进行耐药乳腺癌的联合治疗具有非常重要的临床应用价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种用于治疗乳腺癌的药物。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述用于治疗乳腺癌的药物的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是一种用于治疗乳腺癌的药物，为抗原冲击的DC与CIK的共培养物(简称AP-DC+CIK的组合方式)，其中，所述抗原为冻融抗原，是由下述方法得到的收集对数生长期的MCF-7/ADR细胞，生理盐水洗涤2遍，1800r/min离心，制成浓度为I X 107/mL的细胞悬液，加入100 u L生理盐水中，放入液氣中，5min后,迅速放入37 C水浴中，待其完全融化后，再次放入液氣中，反复3次，微孔滤膜过滤，收集滤液，4°C保存备用；所述抗原冲击的DC是由下述方法得到的收集健康人外周血细胞，通过淋巴细胞分离液体分离获得单个核细胞，置于含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培养基中，在37°C饱和湿度、5%C02孵箱中培养2h后，收集黏附细胞，加培养液调细胞浓度为I X IOVmL,接种于24孔培养板，加入终浓度为1000U/mL的rhGM_CSF、500U/mL的rhIL_4，在37°C饱和湿度、5%C02孵箱中培养，48h进行半量换液并加入首次浓度1/2量的上述细胞因子，在培养到第5天时，部分DC和上述冻融抗原按原细胞数I : 5进行冻融抗原冲击，于第7天加入TNF- a 1000U/mL,继续培养至第8天；所述CIK是由下述方法得到的收集单个核细胞中的非黏附细胞，并用R/MINI-1640完全培养基调细胞数为3 X 107mL，接种于24孔平底培养板，当天加入1000U/mL的rhINF- y，刺激24h后，加入抗CD3单抗50 u g/L及300U/mL的rhIL_2，以后每3天以含有300U/mL的rhIL-2的新鲜CIK培养液全量换液，培养到第7天。优选的，上述用于治疗乳腺癌的药物，所述DC与CIK细胞的体积比为I : 10。上述用于治疗乳腺癌的药物的制备方法，将抗原冲击的DC与CIK进行共培养，具体步骤为(I)制备抗原收集对数生长期的MCF-7/ADR细胞，生理盐水洗涤2遍，1800r/min离心，制成浓度为IXlOVmL的细胞悬液，加入IOOii L生理盐水中，放入液氮中，5min后，迅速放入37°C水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，反复3次，微孔滤膜过滤，收集滤液，4°C保存备用，得到冻融抗原； (2)制备抗原冲击的DC :收集健康人外周血细胞，通过淋巴细胞分离液体分离获得单个核细胞，置于含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培养基中，在37°C饱和湿度、5%C02孵箱中培养2h后，收集黏附细胞，加培养液调细胞浓度为I X 106/mL,接种于24孔培养板，加入终浓度为1000U/mL的rhGM-CSF、500U/mL的rhIL-4，在37°C饱和湿度、5%C02孵箱中培养，48h进行半量换液并加入首次浓度1/2量的上述细胞因子，在培养到第5天时，部分DC和上述冻融抗原按原细胞数I : 5进行冻融抗原冲击，于第7天加入TNF- a 1000U/mL,继续培养至第8天；(3)所述CIK是由下述方法得到的收集单个核细胞中的非黏附细胞，并用R/MINI-1640完全培养基调细胞数为3 X 107mL，接种于24孔平底培养板，当天加入1000U/mL的rhINF- y，刺激24h后，加入抗CD3单抗50 u g/L及300U/mL的rhIL_2，以后每3天以含有300U/mL的rhIL-2的新鲜CIK培养液全量换液，培养到第7天；(4)将上述CIK细胞与上述抗原冲击的DC继续共培养。优选的，上述用于治疗乳腺癌的药物的制备方法，所述步骤(4)中DC与CIK细胞按照体积比I : 10的比例共培养15天。本专利技术的有益效果是上述用于治疗乳腺癌的药物，其中CIK细胞是来源于T淋巴细胞的具有免疫活性的异质细胞群，具有较强的抗肿瘤毒性，可以杀伤对化疗耐药的肿瘤细胞，是治疗多药耐药肿瘤的最具潜力的方法，DC细胞是最具潜力的抗原提呈细胞，可以识别、加工、提呈抗原给T细胞，是激发特异性免疫应答的中心和抗肿瘤免疫的重要载体，AP-DC+CIK的组合方式对于抑制肿瘤的生长、延长患者生存时间的效果突出；所述制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。附图说明图I是各组肿瘤标本RT-PCR检测MDRl和P -actin结果，其中I :AP_DC+CIK治疗组，2 DC+CIK治疗组，3 :CIK单独治疗组，4 :生理盐水对照组；图2是TUNEL染色检测示肿瘤细胞凋亡(TUNEL X 400)； 图3是各组荷瘤标本BCL-2染色结果(免疫组化X 200 );图4是各组荷瘤标本Bax免疫组化染色结果(免疫组化X 400)。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术所述技术方案作进一步的说明。下述实施例中所用材料包括SPF级SCID裸鼠，5飞周龄，购自北京军事医学科学院动物研究所；R/MINI_1640粉剂(美国Hyclone公司)、新生牛血清(HycloneLaboratories Inc),淋巴细胞分离液(Sig_ma)、重组人巨卩遼细胞集落刺激因子(rhGM-CSF )、重组人白细胞介素(rh IL ) -4、重组人肿瘤坏死因子(rhTNF ) - a、rh IL-2、(Bioscience公司)、抗人⑶3单抗(北京思科达生物科技有限公司)；RNA提取试剂盒、一步法 RT-PCR 试剂盒(QIAGEN 公司)，MDRl 引物上游 5’ -CCCATCAITGCAATAGCAGG-3’，下游 5’-TGITCAAACTTCTGCTCCTGA-3’，总长 158bp ; P-actin 内参引物上游5’ -GCCAACACAGTGCTGTCTGG-3’，下游 5’ -GCTCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3 ’，总长 12 Ibp ;琼脂糖凝胶(上海生工公司)，TUNEL试剂盒(罗氏公司)，抗人BAX单抗(北京中杉)，抗人BCL-2单抗、免疫组化二抗试剂盒(基因科技公司)。实施例I( I)靶细胞及细胞冻融抗原的制备 MCF-7/ADR细胞购自中国医学科学院血液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于治疗乳腺癌的药物，其特征在于：为抗原冲击的DC与CIK的共培养物，其中，所述抗原为冻融抗原，是由下述方法得到的：收集对数生长期的MCF?7/ADR细胞，生理盐水洗涤2遍，1800r/min离心，制成浓度为1×107/mL的细胞悬液，加入100μL生理盐水中，放入液氮中，5min后，迅速放入37℃水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，反复3次，微孔滤膜过滤，收集滤液，4℃保存备用；所述抗原冲击的DC是由下述方法得到的：收集健康人外周血细胞,通过淋巴细胞分离液体分离获得单个核细胞，置于含10%新生牛血清的R/MINI?1640完全培养基中，在37℃饱和湿度、5%CO2孵箱中培养2h后，收集黏附细胞，加培养液调细胞浓度为1×106/mL，接种于24孔培养板，加入终浓度为1000U/mL的rhGM?CSF、500U/mL的rhIL?4，在37℃饱和湿度、5%CO2孵箱中培养，48h进行半量换液并加入首次浓度1/2量的上述细胞因子，在培养到第5天时，部分DC和上述冻融抗原按原细胞数1∶5进行冻融抗原冲击，于第7天加入TNF?α1000U/mL，继续培养至第8天；所述CIK是由下述方法得到的：收集单个核细胞中的非黏附细胞，并用R/MINI?1640完全培养基调细胞数为3×106/mL，接种于24孔平底培养板，当天加入1000U/mL的rhINF?γ,刺激24h后，加入抗CD3单抗50μg/L及300U/mL的rhIL?2，以后每3天以含有300U/mL的rhIL?2的新鲜CIK培养液全量换液，培养到第7天。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：庞华，司玉玲，孙雯雯，
申请(专利权)人：庞华，司玉玲，孙雯雯，
类型：发明
国别省市：