通过减少净化血液或骨髓中的一些细胞群的系统技术方案

本发明专利技术公开了一种通过从样品中减少红细胞、粒细胞或血小板中的至少一种而从血或骨髓中纯化并收集一些细胞群的装置和方法，所述样品包括血液、骨髓或从脂肪组织中分离的间质血管部分细胞。该装置包括：无菌、单次使用的刚性的、自撑式的仓盒，在其内自动化减少、纯化和收集目标细胞群并且所有组分可以被分配。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过减少净化血液或骨髓中的一些细胞群的系统相关申请本申请要求美国临时申请序列号61/315,109，提交日20年3月18日以及美国临时申请序列号61/436,964,提交日21年1月27号的优先权。这些临时申请所披露的全文内容被纳入本文。背景
本专利技术涉及细胞分离系统，特别是涉及用于从常规血液、胎盘/脐带血、骨髓或曾经从脂肪组织分离的间质血管部分(stromalvascularfraction)(SVF)细胞中减少(depleting)一些血液成分的系统。专利技术背景正常人体血液通常包括血小板(“PLTs”)、血浆、红细胞(“RBCs”)、白细胞(“WBCs”)，以及，非常少量的干细胞和祖细胞(SPCs)。平均的(因人而异，且随着时间的推移，同体也不同)RBCs组成个体的血细胞总数的约99.9％，占个体总血体积量的约45％。RBCs具有非常重要的功能，其是输送氧气到身体组织的主要装置。几乎所有的个人的血液体积的其余部分包括血浆、非细胞的液体组分，以及占血液总体积的约55％，并且所有的血细胞悬浮在其中。因此，超过99体积％的常规血液是由血浆和RBCs组成。剩余的约<0.6体积％的正常血由所有其他血细胞类型和PLTs组成。PLTs是小的、形状不规则的无核细胞，其在数目上多于WBCs，系数为～10。PLTs在伤口护理中发挥着重要作用，可以止血和释放大量的生长因子以修复和再生受损组织。其次最普遍的血细胞是WBCs，在典型的血样中，其数目只有约1％细胞总数的十分之一。然而，WBCs是人体的免疫系统的关键，保护身体免受传染病和异物侵袭。WBCs可以进一步划分为更小的子群。最大的这样的子群是粒细胞(GRNs)，约占所有WBCs的60％，其他的约40％是单核细胞(MNCs)。在整个本申请中，使用术语WBC可能专指GRNs，专指MNCs，或两者的某种组合。MNCs可以进一步细分成淋巴细胞和单核细胞，但由于在每个细胞的单轮核(singleroundnucleus)的存在，可被统称为MNCs。MNCs是免疫系统的关键元素，其包括T细胞、B细胞和NK细胞，其迁移到身体组织的感染处，然后分裂和分化成巨噬细胞和树突状细胞，以诱发免疫反应。最后，MNCs自己可以进一步划分成更小的子类-包括极少量的多能造血(造血)干细胞和祖细胞以及间充质(骨、脂肪、软骨、肌肉和皮肤形成)干细胞和祖细胞(mesenchymal(bone,fat,cartilage,muscleandskinforming)stemandprogenitorcells)，都对人体健康起关键作用。MNCs的另外来源是间质血管部分细胞(SVFCs)，其已从在吸脂过程期间从个人移去的脂肪细胞中分离。在业界，每年抽取超过25百万次常规血样、胎盘/脐带血样或骨髓样品。由于样品通常是作为治疗疾病的研究的一部分，或用于直接的临床治疗，最经常分离的血细胞是WBCs，其次是MNCs。MNCs包括所有的干细胞和祖细胞，及约40％的极为重要的免疫细胞。因此，大多数情况下，所需要的细胞只是针对典型样品抽取的细胞的非常小的部分。因此，如果需要相对纯化的细胞群，该细胞群含有基本上所有的干细胞和祖细胞(SPCs)且减少基本上所有的RBC，有必要分离上述血液或骨髓的成分，以便分离出WBCs，如果需要更高的纯度，分离出MNCs。由于研究、临床试验以及保健医疗实践对SPC的需求不断增长，特别迫切需要一致的、有效的工艺来分离这些细胞群以及收集靶细胞。对SPCs的兴趣和研究是惊人的。截至20年11月，全球已发表超过100,800干细胞的研究论文。目前全世界有至少7000名基础研究人员集中研究SPCs。仅在美国，有大约300个干细胞研究中心，以及约10000个个人实验室。作为这种广泛研究的结果，有199个临床试验中使用脐带血造血干细胞，34个临床试验中使用脂肪组织和1405个使用骨髓干细胞的临床试验目前正在进行，其根据clinicaltrials.gov，美国国立卫生研究院的网站(NIHwebsite)。相关技术详述从全血或骨髓吸出物样品(aspiratesample)中分离和收集一些类型的细胞的常规方法，一般涉及对样品离心。在离心过程中，根据它们的密度，细胞群倾向于迁移到沿轴线上从小到大加速度的相对位置，并且分层富集，在该过程中，置换其他更高和更低的密度类型的细胞和血浆。图1示出在人的血液中发现的各种细胞类型的密度和平均直径。当血液离心时，不同类型的细胞之间的物理差异是很重要的。当血液离心时，细胞开始以根据许多流体动力学因素、包括Stokes定律、的速度移动到新的位置。事实上，所有的细胞保持轻微的负电荷阻碍细胞膜与细胞膜的直接接触。在主要包括血浆和相对较少的细胞的环境中，较大的细胞会更迅速地移动。然而，当细胞的浓度上升时，细胞电荷(cellcharge)的效应开始主要决定细胞速度。然而，在所有的情况下，密度越大的细胞，其最终将迁移和停留在容器的越低的位置(即，越远离离心机的旋转轴线)。因此，如图2所示，密度最大的细胞，RBCs(具有的密度在1.08和1.12之间)，将迁移到离心分离的容器的底部。在RBC层内的有核红细胞(其存在于脐带血和骨髓中，但不存在于常规血液中)将在红细胞部分的顶部。在RBCs的顶部是GRNs(密度1.07-1.11)，然后，以靠近容器中的旋转轴线的顺序，淋巴细胞(密度1.05-1.09)、单核细胞(密度1.045-1.0750)和PLTs(1.03-1.065)。已知SPCs最接近单核细胞和淋巴细胞的密度，从而如果更大量的这些细胞被捕获，就可捕获SPC。通过利用在一定的条件下形成的公知层，可以通过仅收集该层而促进收集这种类型的细胞。图2还示出常规血、脐带血和骨髓的典型样品中的血细胞类型的相对频度，并最后，表明通过密度组织的细胞群中有些重叠，如下面将要讨论的那样。虽然在进行细胞分层时，一般只需要施加高的G力超过设定的时间，但是精确地移出特定的细胞层是有问题的。为了说明给定样品中的一些细胞种群的稀有和体积小，图3、4和5详细示出了离心和分层后，每个细胞种群在正常血(NB)、脐带血(CB)和骨髓(BM)中各自的平均体积。图3和图4示出，基本上大多数的细胞是RBCs，而图5清楚地示出非RBC血液细胞成分的体积是如此之小，即使在200毫升的脐带血样品中，所有GRNs(上线)、MNCs(中间线)和PLTs(下线)的总体积大约是1毫升。在脐带血中，每1000个血细胞(细胞总数的约0.08％)不到1个MNC。在包含10000RBCs的脐带血样中，预期可以找到40-200PLTs、3-6MNCs和5-10粒细胞。正如所说明的那样，大多数血液的大部分、按细胞数以及按体积计、是由WBCs以外的细胞组成。由于这些WBCs的稀缺性和其在充斥大量的RBCs的溶液中滞留(residence)，目前的分离WBCs的方法是(A)劳动和时间密集的，需要优秀的实验室技术，(B)通常不能在无菌的环境中完成，(C)通常WBCs捕获效率只有50-75％(25％至50％的WBCs损失)，和(D)涉及可能会不利地影响细胞功能的过程。鉴于典型的血样的小尺寸和在常规血中SPCs是极其罕见的事实，在常规血液的典型的W本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.18 US 61/315,109;2011.01.27 US 61/436,9641.用于从样品中减少红细胞、粒细胞或血小板中的至少一种的方法，其中所述样品包括血液、骨髓或从脂肪组织分离的间质血管部分细胞，该方法包括：a．在离心机内放置刚性仓盒，所述刚性仓盒包括大致漏斗状的刚性室、第一刚性贮藏腔室和第二刚性贮藏腔室，其中所述刚性室具有流体连接到初始封闭的阀系统的端部；b．转移所述样品到所述刚性室中，所述样品包括血小板、血浆、高密度细胞和低密度细胞；c．离心所述刚性仓盒，使得所述样品在至少10G的第一G力下，然后由低于所述第一G力但大于1G的第二G力下被推向所述端部；d．提供第一通路，使所述高密度细胞通过所述端部到所述第一刚性贮藏腔室；e．跟踪所述高密度细胞通过所述端部的迁移；以及f．提供第二通路，使所述低密度细胞以及一定量的血小板和血浆通过所述端部到所述第二刚性贮藏腔室，其中使被排出的细胞经过多个发射器/探测器对。2.根据权利要求1的方法，其中所述跟踪以光学方式进行。3.根据权利要求1的方法，其中所述提供步骤利用所述阀系统。4.根据权利要求1的方法，还包括检测所述的第一G力和第二G力。5.根据权利要求1的方法，还包括从所述样品减少至少一种额外的细胞类型。6.根据权利要求5的方法，进一步包括以下步骤：a．在所述离心步骤之后，减速所述刚性仓盒到1G的G力，并且其中部分所述样品保留在所述刚性室中；b．搅拌所述刚性仓盒以混合所述部分；并且c．离心所述刚性仓盒至大于1G的G力用于后续处理。7.根据权利要求1所述的方法，其中多个柔性导管连接所述刚性室到所述第一和所述第二刚性贮藏腔室，且其中，所述柔性导管的长径比不超过20。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述的阀系统包括凸轮和柔性导管。9.根据权利要求1所述的方法，其中在所述提供步骤之前，抗体珠被引入到所述样品。10.根据权利要求9的方法，其中所述抗体珠大约和RBCs一样密集。11.根据权利要求9的方法，其中所述抗体珠浮在血浆中。12.根据权利要求1的方法，其中所述样品还包含荧光材料。13.根据权利要求12的方法，进一步包括跟踪所述荧光材料步骤。14.根据权利要求1的方法，进一步包括以下步骤：a．在所述离心步骤之后，减速所述刚性仓盒到1G的G力，并且其中部分所述样品保留在所述刚性室中；b．搅拌所述刚性仓盒以混合所述部分；以及c．离心所述刚性仓盒至大于1G的G力用于后续处理。15.如权利要求14所述的方法，其中在所述提供步骤之前，一种抗体珠被引入到所述样品。16.根据权利要求15的方法，其中所述抗体珠大约和RBCs一样密集。17.根据权利要求15的方法，其中所述抗体珠浮在血浆中。18.根据权利要求14的方法，其中所述样品还包含荧光材料。19.根据权利要求18的方法，进一步包括跟踪所述荧光材料步骤。20.根据权利要求1的方法，进一步包括添加红细胞沉降加速剂的步骤。21.用于从样品中减少红细胞、粒细胞或血小板中的至少一种的方法，所述样品包括血液、骨髓或从脂肪组织分离的间质血管部分细胞，该方法包括：a．提供：i．离心机，其具有旋转轴线；以及ii．样品，包括血浆和高密度的第一部分以及低密度的剩余部分；iii．刚性仓盒，包括：(1)．大致漏斗状的内部刚性室，其具有出口；(2)．第一刚性贮藏腔室和第二刚性贮藏腔室；(3)．输入口；(4)．阀系统，其联通所述出口和所述刚性贮藏腔室；以及iv．传感器；b．通过将所述样品通过所述输入口转移到所述刚性室而将所述样品置于所述刚性仓盒内；c．离心所述刚性仓盒，使得所述第一部分首先由所述阀系统引导通过离心力被推向所述出口，然后被推向所述旋转轴线并进入所述第一刚性贮藏腔室；以及d．由所述阀系统引导一定量的所述剩余部分朝向所述旋转轴线并进入所述第二刚性贮藏腔室，其中使被排出的细胞经过多个发射器/探测器对。22.根据权利要求21的方法，其中所述的阀系统包括凸轮和柔性导管。23.根据权利要求21的方法，其中所述传感器是光学传感器。24.根据权利要求21的方法，还包括利用所述传感器跟踪所述第一部分通过所述出口的活动。25.根据权利要求21的方法，其中所述刚性室进一步包括小的端部，且其中，所述出口定位在所述小的端部。26.根据权利要求21的方法，还包括分层所述样品，从而生成至少一个界面。27.根据权利要求26的方法，还包括利用所述传感器检测所述至少一个界面。28.根据权利要求26的方法，其中所述分层步骤产生第一和第二界面。29.根据权利要求28的方法，还包括利用所述传感器检测所述第一和第二界面。30.根据权利要求29的方法，其中所述引导步骤发生在所述传感器检测所述第一界面之后。31.根据权利要求29的方法，其中所述引导步骤发生在所述传感器检测所述第二界面之后。32.根据权利要求31的方法，还包括利用所述传感器跟踪所述第一部分通过所述出口的活动。33.根据权利要求21的方法，进一步包括以下步骤：e．在所述离心步骤之后，从高于10G的G力减速刚性仓盒到大约1G的G力，并且其中：i．基本上大多数所述第一部分在所述第一刚性贮藏腔室内；且ii．基本上大多数所述剩余部分在所述刚性室中；f．通过搅拌所述刚性仓盒以混合所述剩余部分；并且g．使所述刚性仓盒恢复到大于1G的G力用于后续处理。34.根据权利要求33的方法，还包括利用所述传感器跟踪所述第一或第二部分通过所述出口的活动。35.根据权利要求34的方法，其中所述传感器是光学传感器。36.根据权利要求35的方法，其中所述光学传感器包括至少一个红外发射器/检测器对。37.用于从样品中减少红细胞、粒细胞或血小板中的至少一种的方法，所述样品包括血液、骨髓或从脂肪组织分离的间质血管部分细胞，该方法包括：a．提供刚性仓盒，包括：i．刚性的外壳；ii．大致漏斗状的内部刚性室，其具有包含出口开口的小的端部以及包含入口开口的大的端部；iii．第一和第二刚性贮藏腔室，其初始不与所述小的端部流体连接；iv．第一阀，联通所述出口开口和所述第一刚性贮藏腔室，其中所述第一阀是初始封闭的；以及v．第二阀，联通所述出口开口和所述第二刚性贮藏腔室，其中所述第二阀是初始封闭的；b．提供离心机，其配置为接纳所述刚性仓盒；c．提供样品，其包括高密度细胞、低密度细胞、血小板和血浆的混合物；d．通过所述入口开口转移所述样品到所述刚性仓盒中；e．将所述刚性仓盒置于所述离心机中；f．施加离心力，以将所述样品推向所述小的端部；g．分层所述样品，以使基本上大多数所述高密度细胞形成高密度成分层和基本上大多数所述低密度细胞形成低密度成分层；h．打开所述第一阀，以使所述成分层迁移向所述小的端部，并且其中通过离心力所述基本上大多数所述高密度细胞被推动首先远离离心机的旋转轴线，然后朝向所述旋转轴线并进入所述第一刚性贮藏腔室；并且i.除去所述离心力，其中使被排出的细胞经过多个发射器/探测器对。38.根据权利要求37的方法，其中第一阀是由凸轮启动。39.根据权利要求37的方法，其中所述第一刚性贮藏腔室包括第一刚性贮藏腔室入口，其定位在比所述出口开口更靠近所述旋转轴线，并且其中所述高密度细胞流过所述第一刚性贮藏腔室入口。40.根据权利要求37的方法，还包括利用传感器检测至少一种所述成分层在所述小的端部的存在。41.根据权利要求37的方法，还包括利用第一和第二传感器检测所述第一和第二成分层的存在，该成分层通过所述小的端部。42.根据权利要求41的方法，还包括闭合所述第一阀并打开所述第二阀，使得通过离心力所述基本上大多数所述低密度细胞和血浆被推动首先远离所述旋转轴线，然后朝向所述旋转轴线并进入所述第二刚性贮藏腔室。43.根据权利要求42的方法，还包括打开所述第二阀之前，预先确定将添加到所述第二刚性贮藏腔室的低密度细胞和血浆的最终体积的步骤。44.根据权利要求43的方法，还包括：j．在检测所述第二成分层之后，计算所述第二阀保持打开状态的时间量，从而使血浆填充所述第二刚性贮藏腔室以使所述最终体积基本上等于所述预先确定的最终体积；以及k．在所述的时间量后关闭所述第二阀。45.根据权利要求44的方法，其中所述计算步骤是基于通过所述第一传感器和所述第二传感器检测其中一个所述成分层之间的时间间隔。46.根据权利要求39的方法，还包括：l．在所述打开步骤后取消离心力；m．在所述取消步骤之后搅拌所述刚性仓盒以混合所述低密度细胞、所述血小板和所述血浆；以及n．重新施加离心力用...

【专利技术属性】
技术研发人员：PH科埃略，
申请(专利权)人：塞恩根股份有限公司，
类型：
国别省市：