重组抗菌肽buforin IIb的生产方法技术

本发明专利技术公开了重组抗菌肽buforin?IIb的生产方法，应用重组DNA技术，构建pSUMO/buforin?IIb原核表达载体，再转化大肠杆菌，构建表达工程菌；工程菌以乳糖为诱导剂诱导表达SUMO-buforin?IIb融合蛋白；然后经细胞破碎后释放出融合蛋白，使用镍离子亲和层析纯化，纯化后的融合蛋白经SUMO酶切反应，释放出buforin?IIb，经镍离子亲和层析分离得到含有His6标签的SUMO蛋白和不含His6的buforin?IIb蛋白。本发明专利技术方法在原核宿主细胞中高效表达了重组抗菌肽buforin?IIb，分离纯化简单，重组蛋白纯度高，易操作，易放大，表达产物稳定性好，适于大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及。
技术介绍
抗菌肽是先天性免疫的分子受动器，通常它们含有15-45个氨基酸残基，净电荷为正。CeciOpins类型的不含半胱氨酸线性肽是最早发现的，来源于昆虫。现已发现抗菌肽、蛋白有800个以上，来源于动物、植物领域。抗菌肽主要作用的靶点是细菌的膜，而且杀伤过程必须比细菌生长的速度快。人们发现许多传统的抗生素，特别是青霉素，能够诱导耐药菌株的产生。为了解决抗生素耐药性的问题，研制新的抗生素或抗菌肽就显得特别重要。抗菌肽具有良好的抗菌选择性和独特的抗菌模式，而且不会诱导产生耐药菌株，容易被降解，不易在微生物体内富集，因此，被认为能够成为替代抗生素的首选药物。1996年Park首次在亚洲蟾餘Bufo bufo gargarizans胃组织中发现了 buforinI,buforin II是由buforin I在胞内蛋白酶Lys-C的作用下裂解而来,是buforin I从Thr到Lys共21个氨基酸残基的烈性抗菌肽。两者在体外都有很强的抗菌活性，其中buforinII的抗菌活性较 buforin I 更强。buforin IIb (RAGLQFPVG 3)是在研究 buforin II的结构-活性关系时发现的一种人工合成多肽，其核苷酸序列见SEQ ID No. I所示，氨基酸序列见SEQ ID No. 2所示,其表现出比buforin II更强的抗菌活性。目前，许多抗菌肽正在开发成药，但是，抗菌肽天然产量非常低，合成肽成本又太高，这成为开发成药的一个瓶颈，通过基因工程技术生产抗菌肽具有广阔的应用前景。国内外对于buforin IIb的基因工程生产方法很少有报道，查到仅有的报道曾采用大肠杆菌表达系统以PruF融合蛋白的形式表达buforin IIb,结果不是十分理想,表达的buforin IIb产物绝大部份以包涵体形式存在,给后续的分离纯化带来不便,设计轻氨切割融合产物对buforin IIb活性也有影响。近年来，SUM0(smallubi quit in-re lated modifier,一种小分子泛素样修饰蛋白)融合表达技术日益受到人们的重视。与传统的融合蛋白表达系统相比，SUMO融合表达系统有两个明显的优势= (I)SUMO不仅能够提高蛋白质在大肠杆菌的表达量，尤其是一些毒性或者小肽，而且能够大大增加蛋白的可溶性；SUM0被发现可用作分子伴侣来增加外源蛋白的稳定性和可溶性，其作用机理可能是SUMO蛋白作为一个高度疏水的核心为目的蛋白的折叠提供成核位点，促进蛋白间的相互作用并使其正确折叠，最终增强了融合蛋白的可溶性。有人对各种不同的融合标签在对蛋白总量及可溶蛋白含量的作用进行了实验比较，他们将三个蛋白模型融合到MBP，GST，TRX, NusA, Ub和SUMO标签的C端，结果表明，在增加蛋白总表达量上为TRX > SUMO > NusA > Ub > MBP > GST ;在可溶蛋白含量上为SUM0> NusA > Ub > GST > MBP > TRX。总体来说，SUMO和NusA在提高蛋白表达量和可溶含量上是等同的。但是，SUMO在一定程度上比NusA更有优势SUM0分子量小；SUM0可以精确的被切除而不留下氨基酸残基。(2) SUMO蛋白酶具有高比活性和高度特异性，IU的SUMO蛋`白酶可以切割100 μ g SUMO融合蛋白。与其它酶切割原理不同的是SUMO蛋白酶识别SUMO3的空间结构，而不是一级结构，这就避免了靶蛋白的非特异切割。由于SUMO蛋白酶的N-端添加了 6xHis标签，大大简化该酶的去除以及目标产物的进一步纯化。而且经过切割的目标产物N-端不会携带多余的氨基酸。另外，IPTG是非常高效的乳糖启动子诱导剂，但其只适用于实验室规模的小量样品制备，应用于大规模发酵生产基因工程重组药物则有一定的局限性一方面IPTG对于人体具有潜在的毒性，从安全角度而言并不合适；另一方面，IPTG较为昂贵。乳糖具备无毒和价廉的优点，使得其在重组蛋白的大规模发酵生产中，具有优于IPTG的潜在价值和优势。我们用乳糖作为诱导剂来启动T7RNA聚合酶基因和bufroin IIb目的蛋白基因的转录，从而短时间大量表达目的蛋白。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题，是提供一种表达效率高、蛋白纯度高、适于大规模工业化生产的。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下,包括如下步骤(I)应用重组DNA技术，将buforin IIb基因插入pSUMO载体中，构建pSUMO/buforin IIb原核表达载体；(2)pSUM0/buforin IIb原核表达载体转化大肠杆菌，构建表达工程菌；(3)将步骤⑵得到的工程菌以廉价无毒的乳糖为诱导剂诱导表达SUMO-buforinIIb融合蛋白；(4)收集步骤(3)诱导表达后的菌体，经细胞破碎后释放出SUMO-buforin IIb融合蛋白，使用镍离子亲和层析纯化，得到纯化后的SUMO-buforin IIb融合蛋白；(5)将纯化后的SUMO-buforin IIb融合蛋白经酶切反应,释放出buforin IIb,经镍离子亲和层析分离得到含有His6标签的SUMO蛋白和不含His6的buforin IIb蛋白。步骤(2)中，所述的大肠杆菌为E. coli Rosetta(DE3)。步骤(3)中，诱导表达方法为将步骤(2)得到的工程菌接种于含卡那霉素50 60mg/L的LB液体培养基，37°C振荡培养16h，然后取IOmL接种到IL LB液体培养基，37°C振荡培养2 4h，0D600达到0. 8 I时，加乳糖至终浓度为0. 8 lg/L，32°C 37°C继续振荡培养8 10h，离心收集菌体。步骤(4)中，所述的细胞破碎方法为超声破碎。步骤(4)或(5)中，所述的镍离子亲和层析使用的是Ni2+-NTA树脂。有益效果本专利技术应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达了重组抗菌肽buforin IIb,经实验验证该重组抗菌肽buforin IIb对多种细菌和真菌具有杀菌作用，且本专利技术表达效率高，分离纯化简单，重组蛋白纯度高，易操作，易放大，表达产物稳定性好，适于大规模工业化生产，对研制新型高效的buforin IIb抗菌药物具有重要价值。附图说明图I为pSUMO-buforin IIb表达载体图谱。图2为重组SUMO-buforin IIb融合蛋白表达SDS-PAGE分析及鉴定。其中，I为未诱导的全菌蛋白；2，3,4分别为挑取三个克隆诱导后的全菌蛋白；5为Western Blotting4鉴定的诱导表达产物。图3为O. 5mMIPTG诱导和lg/L乳糖诱导的重组buforin IIb表达产物SDS-PAGE分析。其中，I为未诱导的菌体蛋白；2，5分别为经lg/L乳糖诱导和O. 5mMIPTG诱导的全菌蛋白；3，6分别为经lg/L乳糖诱导和O. 5mMIPTG诱导破碎后的上清蛋白；4，7分别为经Ig/L乳糖诱导和O. 5mMIPTG诱导破碎后的沉淀蛋白。图4为重组buforin IIb的纯化。其中，a为LPDataView监控下的融合蛋白Ni-NTA亲和纯化；b为SDS-PAGE本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组抗菌肽buforin？IIb的生产方法，其特征在于，它包括如下步骤：(1)应用重组DNA技术，将buforin？IIb基因插入pSUMO载体中，构建pSUMO/buforin？IIb原核表达载体；(2)pSUMO/buforin？IIb原核表达载体转化大肠杆菌，构建表达工程菌；(3)将步骤(2)得到的工程菌以乳糖为诱导剂诱导表达SUMO？buforin？IIb融合蛋白；(4)收集步骤(3)诱导表达后的菌体，经细胞破碎后释放出SUMO？buforin？IIb融合蛋白，使用镍离子亲和层析纯化，得到纯化后的SUMO？buforin？IIb融合蛋白；(5)将纯化后的SUMO？buforin？IIb融合蛋白经酶切反应，释放出buforin？IIb，经镍离子亲和层析分离得到含有His6标签的SUMO蛋白和不含His6的buforin？IIb蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：殷志敏，王期，周军，
申请(专利权)人：南京巴傲得生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：