本发明专利技术公开了一种从肝素副产物中分离提纯肝素钠和硫酸乙酰肝素的方法，其包括将原料肝素副产物溶解后加入醋酸钾使肝素钠沉淀分离，沉淀溶解后再加入醋酸钾沉淀，收集沉淀，溶解后经过无水乙醇多次分级沉淀，进而制得纯度较高的肝素钠；上清液通过加入班氏试剂和饱和氢氧化钠溶液，离心得到含有硫酸乙酰肝素的溶液，以除铜剂除去铜离子，加入活性炭吸附沉淀并脱色后过滤，再通过阴离子交换树脂吸附和洗脱，分离得到高纯度的硫酸乙酰肝素。本发明专利技术能够同时从生产肝素钠的副产物中再次分离得到高纯度的肝素钠和硫酸乙酰肝素，解决了存储或丢弃大量肝素副产物所需财力和物力，并变废为宝，将副产物再次利用，既节约了大量成本，又创造了价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种，属于粘多糖生物制药领域。
技术介绍
肝素钠是粘多糖硫酸酯类抗凝血药，近年来研究证明肝素钠还具有降血脂作用。硫酸乙酰肝素是肝素的亚成分，存在于未分离的肝素中。与肝素钠相比，硫酸乙酰肝素具有抗凝活性缓和的优点。硫酸乙酰肝素用于抗栓、抗炎、降血脂及糖尿病患者肾脏保护，是近年来研究最热的粘多糖类生化药物。从猪小肠粘膜经过离子交换以及分级沉淀生产肝素的过程中产生了大量的副产 物，即肝素副产物，其中主要组成是硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素和肝素钠，其含量因副产物的旋光度不同而有所差异。但是由于其中的有效物质分离困难，故生产肝素后一般将这些副产物丢弃或存储，或者只做简单处理，如传统工艺主要是从肝素副产物中提纯硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素，而肝素钠则弃去，造成一定的损失。硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素性质相似，采用通常的离子交换层析和有机溶剂分级沉淀方法难以将硫酸乙酰肝素纯化。现有技术中，利用硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素与班氏试剂的特殊反应实现两者的分离，但是在分离得到的硫酸乙酰肝素溶液中，含有大量铜离子。专利(200910039359. 9)通过离子交换层析柱的吸附和洗涤去除铜离子，不仅容易降低树脂寿命，而且难以将铜离子除尽，使得硫酸乙酰肝素粗品仍带有淡蓝色，经原子吸收分光光度法测定，铜离子含量超过30ppm。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从肝素副产物中同时分离出质量稳定的高纯度的肝素钠和硫酸乙酰肝素的方法，该法适合于工业生产，生产成本低廉，工艺简单。本专利技术的目的可以通过以下措施达到一种，其特征是按以下步骤①.将原料肝素副产物溶解于纯化水中得到浓度为5-20%(w/v)的溶液，加入醋酸钾，使溶液中醋酸钾的含量达30-60% (w/v)，用醋酸调节溶液的pH值至5-7后，在18_20°C下沉淀20-80小时，离心分离沉淀和上清液；②.收集步骤①所得的沉淀，以该沉淀为原料重复步骤①的操作；③.收集步骤②所得的沉淀，用纯化水溶解后，加入无水乙醇进行沉淀；得到的沉淀物重复纯化水溶解和无水乙醇沉淀的步骤，最后收集沉淀，干燥，得到肝素钠；④·向步骤①所得的上清液中，加入O. 2-1. 2倍体积的班氏试剂和O. 1-0. 8倍体积的饱和氢氧化钠溶液，于20-25°C下沉淀后，分离沉淀和上清液；⑤.步骤④所得的上清液加入硫化钠，静置沉淀1-3小时，再加入活性炭搅拌后过滤；⑥.步骤⑤得到的清液中加入1-5倍纯化水稀释，并调节溶液的pH值至5-7，然后加入阴离子交换树脂搅拌吸附，弃去吸附液，树脂浙干；⑦.先以浓度为O. 1-0. 5mol/L的氯化钠溶液洗涤树脂，树脂浙干；⑧.再以浓度为2. 0-4. Omol/L的氯化钠溶液洗脱树脂，收集洗脱液，过滤洗脱液后加入无水乙醇进行沉淀，收集沉淀物，重复纯化水溶解和无水乙醇沉淀的步骤，最后收集沉淀物，干燥，得到硫酸乙酰肝素。在步骤①中，原料肝素副产物可采用生产肝素钠获取的副产物(湿料)脱水干燥并称重后为原料，以便于后续处理和计算。原料肝素副产物旋光度的不同体现了其主要成分硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素和肝素钠的含量差异。该步骤中的肝素副产物水溶液的浓度优选为5-10%，溶液中醋酸钾的含量优选为30-40%，沉淀处理时间优选为20-50小时。在步骤②中，收集步骤①所得的沉淀，重新进行溶解于纯化水中、加入醋酸钾、用醋酸调节PH值、沉淀以及分离的操作，其条件同步骤①。在步骤③中，纯化水的用量以能完全溶解沉淀物为佳，无水乙醇的用量以使溶液中不再继续产生沉淀为佳。在步骤④中，该步骤中可采用离心或过滤等方式分离沉淀和上清液，优选采用离心分离。在步骤⑤中，硫化钠的加入量优选为10_12%(w/v)。活性炭的加入量为9_ll%(w/V)。加入活性炭后的搅拌时间一般为5-100分钟，优选10-30分钟。·在步骤⑥中，所述的阴离子交换树脂为丙烯酸类强碱性阴离子交换树脂。其中中阴离子交换树脂搅拌吸附时间为1-20小时，优选2-6小时。在步骤⑦中，以浓度为O. 1-0. 5mol/L的氯化钠溶液洗涤树脂时间一般为1_5小时。在步骤⑧中，以浓度为2. 0-4. Omol/L的氯化钠溶液洗脱树脂时间一般2_10小时。本专利技术的有益效果本专利技术方法利用它们在水中溶解度存在差异这一特点，加入醋酸钾使肝素钠从肝素副产物中沉淀分离，沉淀溶解后再加入醋酸钾沉淀，收集沉淀，溶解后经过无水乙醇多次分级沉淀，进而制得纯度较高的肝素钠；上清液通过加入班氏试剂和饱和氢氧化钠溶液，离心得到含有硫酸乙酰肝素的溶液，以除铜剂除去铜离子，加入活性炭吸附沉淀并脱色后过滤，再通过阴离子交换树脂吸附和洗脱，分离得到高纯度的硫酸乙酰肝素，经原子吸收分光光度法测定，硫酸乙酰肝素中铜离子的含量不超过8ppm，能够有效地除去铜离子。本方法可直接得到肝素钠精品和硫酸乙酰肝素品精品。本专利技术解决了上清液加入班氏试剂和饱和氢氧化钠溶液后，经离子交换层析柱难以除尽铜离子的问题。本法在阴离子交换树脂吸附硫酸乙酰肝素前使用除铜剂将铜离子以沉淀形式过滤除去，由于沉淀细小，不易沉降，使用吸附剂搅拌后再过滤，所制得的硫酸乙酰肝素具有更高的纯度，且不需要后续再次除铜步骤，可直接用作硫酸乙酰肝素的原料药。本专利技术能够同时从生产肝素钠的副产物中再次分离得到高纯度的肝素钠和硫酸乙酰肝素，解决了存储或丢弃大量肝素副产物所需财力和物力，并变废为宝，将副产物再次利用，即节约了大量成本，又创造了价值。具体实施例方式实施例一(I)原料为肝素钠生产的副产物260kg，测得的旋光值为-34. 5°，将原料溶解于纯化水中，使原料浓度为5%(g/mL)，加入醋酸钾，使醋酸钾的含量为30%，调节pH至6，在温度18-20°C下静置24小时。(2)离心收集沉淀，溶解为5%(g/mL)的溶液，加入醋酸钾，使醋酸钾的含量为30%(g/mL)，用醋酸调节pH至6，在温度18_20°C下静置24小时。 (3)离心收集沉淀，用纯化水溶解后，加入无水乙醇沉淀，离心收集沉淀后再次用纯化水溶解，以无水乙醇沉淀。收集沉淀并脱水干燥，得肝素钠18. 6kg。测得肝素钠精品的旋光为55°，抗凝血效价为176USP u/mg。(4)步骤⑴所得上清液加入O. 2倍班氏试剂和O. 5倍饱和氢氧化钠溶液，室温下沉淀30分钟，离心分离沉淀和上清液。(5)步骤(4)所得上清液加入适量硫化钠使其浓度为10%(g/mL)，搅拌后，静置沉淀I. 5小时，加入适量活性炭使其浓度为10%(g/mL)，搅拌60分钟后过滤。(6)步骤(5)过滤得到的清液加入I倍纯化水稀释，用浓盐酸调节pH至7。加入丙烯酸类强碱性阴离子交换树脂搅拌吸附2小时后，弃去吸附液，浙干。(7)用O. lmol/L的氯化钠溶液洗涤树脂2小时，浙干后再次用O. lmol/L的氯化钠溶液洗涤树脂I小时。树脂浙干。(8)将树脂加入4. Omol/L的氯化钠溶液洗脱6小时，分离洗脱液后再次用4.Omol/L的氯化钠溶液洗脱2小时，合并2次洗脱液。加入无水乙醇沉淀，收集沉淀后加入纯化水溶解后加入无水乙醇沉淀。收集沉淀用无水乙醇脱水并烘干，得到白色粉末32kg，SP为硫酸乙酰肝素。测得硫酸乙酰肝素精品的旋光为38°，抗凝血效价为52USP u/mg，经原子吸收分光光度法测定，硫酸乙酰肝素中铜本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从肝素副产物中分离提纯肝素钠和硫酸乙酰肝素的方法，其特征是按以下步骤：①.将原料肝素副产物溶解于纯化水中得到浓度为5？20%（w/v）的溶液，加入醋酸钾，使溶液中醋酸钾的含量达30？60%（w/v），用醋酸调节溶液的pH值至5？7后，在18？20℃下沉淀20？80小时，离心分离沉淀和上清液；②.收集步骤①所得的沉淀，以该沉淀为原料重复步骤①的操作；③.收集步骤②所得的沉淀，用纯化水溶解后，加入无水乙醇进行沉淀；得到的沉淀物重复纯化水溶解和无水乙醇沉淀的步骤，最后收集沉淀，干燥，得到肝素钠；④.向步骤①所得的上清液中，加入0.2？1.2倍体积的班氏试剂和0.1？0.8倍体积的饱和氢氧化钠溶液，于20？25℃下沉淀后，分离沉淀和上清液；⑤.步骤④所得的上清液加入硫化钠，静置沉淀1？3小时，再加入活性炭搅拌后过滤；⑥.步骤⑤得到的清液中加入1？5倍纯化水稀释，并调节溶液的pH值至5？7，然后加入阴离子交换树脂搅拌吸附，弃去吸附液，树脂沥干；⑦.先以浓度为0.1？0.5mol/L的氯化钠溶液洗涤树脂，树脂沥干；⑧.再以浓度为2.0？4.0mol/L的氯化钠溶液洗脱树脂，收集洗脱液，过滤洗脱液后加入无水乙醇进行沉淀，收集沉淀物，重复纯化水溶解和无水乙醇沉淀的步骤，最后收集沉淀物，干燥，得到硫酸乙酰肝素。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：段艳冰，辛妮，王永毅，
申请(专利权)人：南京健友生化制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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