本发明专利技术涉及一种用于DNA单链与蛋白质分子检测的电化学传感器的构建方法，通过在传统的DNA电化学传感器设计基础上，通过引入一个独特的附加DNA探针，起到了DNA单链检测的信号增强效应，并可以进一步应用到基于核酸适体的蛋白质电化学传感器中。本发明专利技术可以解决传统的用于DNA单链与特异蛋白质分子检测的电化学传感器件所固有的检测灵敏度低、前处理过程繁琐、检测底限浓度高的缺点，在DNA电化学传感器领域中具有很好的推广价值。
【技术实现步骤摘要】
用于DNA单链与蛋白质分子检测的电化学传感器的构建方法
本专利技术涉及分析检测技术，尤其涉及一种用于DNA单链与蛋白分子检测的电化学传感器。
技术介绍
近年来由于在疾病早期诊断、生物标志物的快速准确检测以及环境监测等领域的快速发展的需求，越来越多的可用于DNA以及特异蛋白质分子检测的生物传感器件受到人们关注。其中电化学传感器由于制作成本低、快速检测以及便携性等优点，逐渐成为研究开发者关注的热点，也被认为是最具有应用价值的DNA以及特异蛋白质分子高灵敏检测方法 之一。在电化学传感器的研发过程中，检测灵敏度的提高是最核心的关键问题。而传统的电化学传感器的构建方法依然存在信号值和检测灵敏度较低、检测低限浓度较高的缺点，从而限制了电化学传感器在DNA以及特异蛋白质分子检测中的应用。
技术实现思路
基于此，本专利技术提供一种可用于DNA单链与特异蛋白质分子检测的电化学传感器，以解决传统电化学传感器信号值较低、灵敏度较低以及检测低限浓度较高的缺点。一种用于DNA单链与蛋白质分子检测的电化学传感器的构建方法，包括如下步骤提供一金盘电极，并对所述金盘电极进行预处理；将预处理后的所述金盘电极在pH 7. 4的浓度为200mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中与O. 5 μ M的捕获探针和5. O μ M的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐进行反应，反应温度为37°C，持续时间为16小时；将上述处理后的含有捕获探针在pH 7.4的浓度为200mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中与O. 5 μ M的附加探针和5. O μ M的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐进行反应，反应温度为37°C，持续时间为16小时；将含有捕获探针和附加探针的金盘电极用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液清洗后，再在PH 7. 4的IOmM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中与6-巯基乙醇反应，温度为30°C，反应时间为2小时；随后清洗所述金盘电极，并将所述金盘电极与O. 5μ M的报告探针在杂交缓冲溶液中反应，温度为40°C，反应时间为4小时，得到所述电化学传感器；其中，所述杂交缓冲溶液为50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、IOOmM氯化钠与质量浓度O. I %的吐温20的混合液，所述杂交缓冲液的PH为7. 4。优选的，所述捕获探针的DNA 序列为5' -HS-(CH2)6_AGA CAA GGA AAATCC TTCCCC CCC CTG AAG TGG GTC GAA M-3/ 或者 5' -Hs-(CH2)6-AGACM GGA AAA TCC TTC CCCCCC CGG TTG GTG TGG TTG G-3/ 。优选的，所述附加探针的DNA序列为5' -AAT GAA GTG GGT CG-(CH2)3-SiKV或5' -GGT TGG TGT GGT TGG-(CH2)3U。优选的，所述报告探针的DNA 序列为# -(CH2)6-MB-CGA CCC ACT TCATTC CCCCCT TGA AGG ATT TTC CTT GTC T-3'或 5' -(CH2)6-MB-CCA ACCACA CCA ACC CCC CCC CCTTGA AGG ATT TTC CTT GTC T-3/ 。进一步优选的，所述捕获探针的DNA序列为5' -HS-(CH2)6-AGA CAA GGAAAA TCCTTC CCC CCC CTG AAG TGG GTC GAA ΑΑ-3'；所述附加探针的DNA 序列为5' -AAT GAA GTG GGT CG-(CH2) s-SH-3;；所述报告探针的DNA 序列为5' -(CH2)6-MB-CGA CCC ACT TCA TTC CCCCCT TGAAGG ATT TTC CTT GTC T-3/ 。 进一步优选的，所述捕获探针的DNA序列为5' -HS-(CH2)6-AGA CAA GGAAAA TCCTTC CCC CCC CGG TTG GTG TGG TTG G-3/ ；所述附加探针的DNA 序列为5' -GGT TGG TGT GGT TGG-(CH2) s-SH-3;；所述报告探针的DNA 序列为5' -(CH2)6-MB-CCA ACC ACA CCA ACC CCCCCC CCTTGA AGG ATT TTC CTT GTC T-3/ 。优选的，金盘电极进行预处理包括如下步骤取直径为2. O毫米的金盘电极，先后用粒径大小分别为I. O毫米、O. 3毫米、O. 05毫米的三氧化二铝粉体打磨抛光，随后将金盘电极依次在二次水、乙醇、丙酮中超声清洗多次；清洗后的金盘电极先后放入O. 5Μ氢氧化钠溶液、O. 5Μ硫酸溶液中进行电化学循环扫描后，用二次水清洗多次，随后将金盘电极用高纯氮气吹干。通过电化学标记物修饰的报告探针和固定于金电极表面的捕获探针形成双链结构，引入的目标检测物可与捕获探针结合，使报告探针末端部分处于半游离状态，并且巧妙的在金电极表面引入一种独特的可以和报告探针末端部分结合的附加探针，使产生的电化学信号得到增强，从而提高了检测灵敏度。本专利技术与传统的用于DNA单链与特异蛋白质分子检测的电化学传感器相比，具有信号增强、灵敏度高以及检测低限浓度低的优点，并且具有很好的推广使用价值。附图说明图I为实施例I中引入附加探针的电化学传感器的构建及检测流程示意图；图2为引入和未引入附加探针的电化学传感器对目标检测物的响应信号对比，其中a为空白信号，b为未引入附件探针得到的信号，c为引入附加探针后得到的信号；图3A 图3D为引入和引入附加探针的电化学传感器对不同浓度的目标检测物的信号对比，其中图3A为未引入附加探针的电化学传感器对浓度分别为0(a)，0. 04nM(b)，O.2nM(c)，InM(d)，and 2nM(e)的目标检测物的响应信号；图3B为引入附加探针的电化学传感器对浓度分别为0(a)，O. 04nM(b)，0· 2nM(c)，InM (d)，and 2nM(e)的目标检测物的响应信号；图3C为未引入附加探针的电化学传感器对不同浓度的目标检测物的线性响应曲线；图3D为引入附加探针的电化学传感器对不同浓度的目标检测物的线性响应曲线；图4为实施例2中用于蛋白质分子凝血酶的电化学传感器构建及检测流程示意图5为引入和引入附加探针的电化学传感器对凝血酶的响应信号对比，其中a为空白信号，b为未引入附件探针得到的信号，c为引入附加探针后得到的信号；图6为引入附加探针的电化学传感器对不同浓度凝血酶的线性响应曲线。具体实施方式下面主要结合附图及具体实施例对用于DNA单链与蛋白质分子检测的电化学传感器的构建方法作进一步详细的说明。实施例I如图I所示，取直径为2. O毫米的金盘电极110 —支，先后用粒径大小分别为I. O毫米、O. 3毫米、O. 05毫米的三氧化二铝粉体打磨抛光，随后将金盘电极110依次在二次水、 乙醇、丙酮中超声清洗多次。清洗后的金盘电极110先后放入O. 5M氢氧化钠溶液、O. 5M硫酸溶液中进行电化学循环扫描后，用二次水清洗多次，随后将金盘电极110用高纯氮气吹 干。处理后的金盘电极110在pH 7.4的浓度为200mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(以下简称Tris-HCl)中与O. 5μ M本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于DNA单链与蛋白质分子检测的电化学传感器的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：提供一金盘电极，并对所述金盘电极进行预处理；将预处理后的所述金盘电极在pH？7.4的浓度为200mM的三羟甲基氨基甲烷？盐酸缓冲溶液中与0.5μM的捕获探针和5.0μM的三(2？羰基乙基)磷盐酸盐进行反应，反应温度为37℃，持续时间为16小时；将上述处理后的含有捕获探针在pH？7.4的浓度为200mM的三羟甲基氨基甲烷？盐酸缓冲溶液中与0.5μM的附加探针和5.0μM的三(2？羰基乙基)磷盐酸盐进行反应，反应温度为37℃，持续时间为16小时；将含有捕获探针和附加探针的金盘电极用三羟甲基氨基甲烷？盐酸缓冲溶液清洗后，再在pH？7.4的10mM三羟甲基氨基甲烷？盐酸缓冲溶液中与6？巯基乙醇反应，温度为30℃，反应时间为2小时；随后清洗所述金盘电极，并将所述金盘电极与0.5μM的报告探针在杂交缓冲溶液中反应，温度为40℃，反应时间为4小时，得到所述电化学传感器；其中，所述杂交缓冲溶液为50mM三羟甲基氨基甲烷？盐酸缓冲溶液、100mM氯化钠与质量浓度0.1％的吐温20的混合液，所述杂交缓冲液的pH为7.4。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，杨坤，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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