一种基于化学衍生的飞蝗血淋巴代谢物的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于化学衍生的飞蝗血淋巴代谢物的检测方法，涉及动物生态学与分析化学领域。具体为：取血淋巴，加入乙醇-乙腈混合溶剂脱蛋白，超声提取，高速离心得代谢物提取液；提取液减压干燥后，加入盐酸甲氧胺-吡啶溶液，超声溶解，涡旋混匀，恒温水浴中肟化衍生；再加入N-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺试剂，涡旋混匀，恒温水浴中硅烷化衍生；最后加入油酸甲酯-正庚烷溶液补充体积，再次涡旋混匀后，备气相色谱-质谱联用技术分析。本发明专利技术的检测方法便捷高效，反应条件温和，重复性好，代谢物覆盖面广泛，适用于开展多中心、大样本的分析研究，能为认识各种飞蝗型变的生物规律与蝗灾的发生机制提供帮助。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物生态学与分析化学领域，是一种基于两步化学衍生的飞蝗血淋巴代谢物的检测方法。
技术介绍
昆虫纲直翅目幢总科动物飞幢(Locusta migratoria)是一种广泛分布于东半球的重大农业害虫，已知全球有9个亚种，其中我国有东亚飞蝗、亚洲飞蝗和西藏飞蝗三个亚种，是引发我国蝗灾爆发的罪魁祸首。飞蝗存在着多型性现象(polymorphism)，在自然界中具有不同的生态型，即群居型和散居型。两型之间可以相互转化，这称之为飞蝗的型变现象。蝗灾爆发的主要特征就是散居型飞蝗型变为群居型，以及群居型飞蝗集群的大规模异地迁飞。研究证实，飞蝗的型变是由生态环境因素与内分泌系统相互作用、共同调节的结果，从而使得两型飞蝗在形态、生理、体色与行为等方面都存在着显著的差异。体液中的代 谢物是机体基因型、内分泌与外部环境共同作用的产物，是机体生物功能与状态的直接反应，两型飞蝗之间的生物差异必然在血淋巴代谢物上有所体现。因此，建立一种便捷高效的飞蝗血淋巴代谢物的检测方法，将有助于深入探讨飞蝗型变的生物规律和中国蝗灾的爆发机制，进而有可能为新型生态友好型生物、化学农药的开发提供新的作用靶点。经过文献检索得知，目前已知的一种分析蝗虫血淋巴中内源性代谢物的技术由E. M. Lenz 等人专利技术(《Insect biochemistry and molecular biology》杂志 2001 年第 32期51-56页)，该专利技术使用500兆赫兹(MHz)核磁共振技术对沙漠蝗4龄期若虫血淋巴中的代谢物进行了检测。除此之外，尚未见其他对飞蝗血淋巴内小分子代谢物进行代谢指纹分析的报道。Lenz等人所专利技术的技术，能检测到包括氨基酸、碳水化合物和有机酸等多种类型的代谢物，但该专利技术也存在显而易见的缺陷1)该专利技术的技术核心是500MHz核磁共振仪，造价与运行成本高昂，远非一般常规实验室所能拥有，满足不了大多数生物实验室的研究需要；2)由于蝗虫血淋巴中的代谢物组成复杂，化学结构多样，导致该专利技术采集到的代谢指纹中存在着严重的谱峰重叠现象，这不单对代谢物结构解析提出了严峻的挑战，而且也干扰了峰面积的积分结果，进而影响代谢物相对含量测定的准确度；3)更为关键的是，该技术获取的代谢信息有限，只从沙漠蝗血淋巴中解析出了 20余种代谢物，生物信息覆盖面狭窄，远远满足不了从系统生物学层面上理解飞蝗生理代谢功能的需要。而气相色谱质谱联用技术作为一种常规而强大的分析手段，相对于核磁共振技术具有以下应用优势1)气相色谱质谱联用技术的造价与运行费用低廉，广泛易得，其在哺乳动物生物体液代谢物分析中的应用价值业已被广泛证实。2)气相色谱质谱联用技术集分离与检测于一身，对复杂体系具有强大的分离和结构解析能力，能大大降低生物谱中的代谢物重叠现象，从而获得更为准确的相对含量测定结果和更为可信的结构鉴定结果。3)相对于核磁共振技术而言，气相色谱质谱联用技术的灵敏度更高，这将有助于检测到更多痕量存在的代谢物，提高代谢信息的覆盖度，从而有助于更为全面地了解飞蝗的代谢状态。通过进一步的文献检索，迄今为止，尚未见基于化学衍生和气相色谱质谱联用技术开展飞蝗血淋巴代谢指纹检测的相关报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有蝗虫血淋巴代谢物检测技术的不足，提出了，以期快速地获取飞蝗血淋巴内小分子代谢物的组成种类与相对含量信息，进而为认识飞蝗型变的生物规律与中国蝗灾的发生机制提供依据。本方法便捷高效，反应条件温和，重复性高，代谢物覆盖范围广，适应多中心、大样本和多批次分析研究的需要。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下(I)取50 μ L血淋巴，室温解冻后，使用含有IOOng/μ L香草酸内标的 乙醇-乙腈混合溶剂(9/1，ν/ν)进行代谢物提取，涡旋lmin，超声2min，4°C下15000g离心15min，吸取120 μ L上清液并减压干燥5h ;实验设计理念与多元统计分析表明该溶剂体系对于血淋巴代谢物具有最佳的提取效率，所反映的生物学信息最为完整全面，且重现性良好。(2)取50 μ L盐酸甲氧胺-吡啶溶液(20mg/mL)加入到前述所得的提取物中，超声Imin溶解，涡旋混匀，40°C恒温水浴中肟化衍生90min ;再加入50 μ LN-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺试剂，涡旋混匀，40°C恒温水浴中硅烷化衍生60min。先肟化再硅烷化的两步化学衍生方法能抑制代谢谱中的多重峰现象，减少代谢谱的复杂程度，从而有助于代谢物结构鉴定，并保证代谢物定量测定的准确度。(3)最后加入20 μ L含有800ng/μ L油酸甲酯的正庚烷溶液补充体积，涡旋混匀后备气相色谱-质谱联用技术分析。油酸甲酯作为外标能用于监控大样本分析时的质谱灵敏度变化，为开展多中心实验时评价分析性能的稳定性提供数据。气相色谱的分离条件为DB-5MS色谱柱(O. 25μηι,0· 25mmX25m),载气为氦气，恒定流量模式操作，流速I. 2mL/min,采用程序升温程序起始70°C维持3min,5°C /min升至170°C，4°C /min 升至 270°C，10°C /min 升至 300°C并维持 5min，进样体积 I μ L，分流比 30，该色谱分离条件能使血淋巴中复杂的代谢物间获得良好的分离。质谱检测条件为电子轰击电离源(EI)，电离电压70eV，离子源温度250°C，溶剂切割时间6. 5min,电子倍增管检测器电压为I. 0KV，质荷比扫描范围为33-500m/z，质谱扫描速率O. 4s/谱图(即质谱扫描速率为每O. 4s 一张谱图)。本专利技术方法的反应条件温和，能减少对热不稳定代谢物的潜在破坏。且方法便捷高效，重复性好，仪器要求低，适合于开展多中心、大样本分析的需要，能广泛用于各种蝗虫的代谢组学研究工作。附图说明图I本专利技术中确定血淋巴代谢物提取溶剂体系的决策结果；图2本专利技术实施例I群居型东亚飞蝗血淋巴代谢物的检测结果(总离子流图)。图3本专利技术实施例2敲除肉碱-乙酰转移酶carnitine-acetyltransferase的群居型东亚飞蝗血淋巴代谢物的检测结果(总离子流图)。表I本专利技术实施例I中血淋巴代谢物的结构鉴定结果及其通路列表。表2本专利技术的方法学验证结果。具体实施例方式实施例I取4龄期群居型东亚飞蝗，使用微量注射器穿刺前胸背板与腹部衔接处的表皮抽吸体液，4°C下13000g离心IOmin得血淋巴，分析前-80°C贮藏。室温解冻后，取50 μ L血淋巴置1.5mL Eppendorf管中，加入150 μ L乙醇-乙腈混合溶剂(9/1, ν/ν)沉淀蛋白，剧烈润旋振荡lmin,超声提取2min,4°C下15000g离心15min,吸取120 μ L上清提取液至另一 I. 5mL Eppendorf管中，冻干机中减压干燥5h。提取物中加入50 μ L盐酸甲氧胺-批唳溶液(20mg/mL),超声Imin溶解,润旋混勻,40°C恒温水浴中厢化反应90min ;随后,加入50 μ LN-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺试剂，涡旋混匀，40°C恒温水浴中硅烷化衍生 60min ;反应完成后，加入20 μ L含有800ng/l·! L油酸甲酯的正庚烷溶液补充体积，涡旋混匀后转移至玻璃衬管中，进行气相色谱质谱联用分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于化学衍生的飞蝗血淋巴代谢物的检测方法，其特征在于，包括如下流程步骤：(1)取血淋巴50？100μL，加入3？4倍体积的乙醇？乙腈混合溶剂提取代谢物，涡旋振荡，超声提取，离心分离上清液并减压干燥；(2)每1μL血淋巴提取液冻干物中加入0.8？1.2μL盐酸甲氧胺？吡啶溶液，超声溶解，涡旋混匀，35？50℃恒温水浴中肟化衍生60？180min；再加入与0.8？12倍吡啶用量体积的N？甲基？N？三甲基硅烷？三氟乙酰胺试剂，涡旋混匀，35？50℃恒温水浴中硅烷化衍生45？90min；(3)加入相当于步骤(1)中血淋巴用量体积40？60％的油酸甲酯？正庚烷溶液，混匀后进行气相色谱？质谱联用技术分析，室温条件下样品分析需在衍生后24h内完成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许国旺，吴泽明，赵春霞，周佳，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：