本发明专利技术涉及植酸酶活性测定，具体的说是一种直接测定土壤植酸酶活性的方法。将甲苯加入到待测定土壤中，而后进行底物培养在待测土壤中加入pH5.5的乙酸缓冲液、植酸钠；待培养终止加入显色液终止酶促反应并显色，显色后在415nm下测定显色液吸光度，即可获得土壤植酸酶。本发明专利技术对土壤中的植酸酶采用直接培养的方法进行测定，操作简便又稳定可靠，基本上达到了对土壤植酸酶活性测定有效、快速的目的。适于对土壤植酸酶活性的直接测定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植酸酶活性测定，具体的说是。
技术介绍
植酸酶属于磷酸单酯水解酶，是一类特殊的酸性磷酸酶，可催化植酸以及植酸盐水解成肌醇与磷酸盐。1968年,Shien等确定第一个被分离纯化的植酸酶来源于土曲霉,并且从68个土样中对2000个菌株进行研究发现，在所得的22株黑曲霉中有21株能产生植酸酶。从此以后，陆续从十几种微生物中分离得到植酸酶。植酸酶主要来源于微生物。微生物来源的植酸酶分解植酸盐的最终产物主要是单磷酸肌醇和无机正磷酸盐。植酸及其盐类广泛存在于植物组织和相应的粮食产品中，占其总量的1_3%，其中磷含量占植物总磷的60-90%，是磷和肌醇的主要储存形式。植酸酶是催化植酸水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称，因此，植酸酶已在饲料和食品工业中广泛地得到应用。而对植酸酶活性的检测成为衡量 饲料、食品、土壤等中的磷素可利用性的一项重要指标。目前在植酸酶活性的检测工作中，常使用紫外分光光度法对酶反应产物正磷酸盐进行检测，并根据植酸酶活性单位的定义，由磷标准曲线计算出待检植酸酶的活性。世界公认的测定方法中，被广泛认可和使用较多的方法是Gostbrocades和BASF公司1991年提出的植酸酶活性的测定方法，但此方法在操作上仍存在不简便，方法稳定性不够，测定结果误差相对较大等缺点。而目前对于土壤中的植酸酶活性的测定方法仍没有形成一套完整且效果较好的体系，更多的是将土壤制成悬浊液后取定量悬液进行培养测定，而此方法操作不简便，误差较大，不能够完全真实的反应土壤植酸酶活性特征。因此，建立一种对土壤植酸酶活性的直接测定方法，提高土壤植酸酶活性测定的效率和准确性，对于评价土壤磷素利用状况具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。为实现上述目的本专利技术采用的技术方案为，将甲苯加入到待测定土壤中，而后进行底物培养在待测土壤中加入PH5. 5的乙酸缓冲液、植酸钠；待培养终止加入显色液终止酶促反应并显色，显色后在415nm下测定显色液吸光度，即可获得土壤植酸酶。所述待测定土壤过筛后称取I. OOg加入O. 2mL甲苯抑制土壤微生物活性。所述底物培养是向经甲苯处理过的测定土壤中加入O. 25mol Ι^ρΗδ. 5的乙酸缓冲液后，再加入2mL浓度O. 00761mol Γ1的植酸钠溶液，轻摇混匀后放入恒温培养箱内在30-40°C恒温条件下密闭培养O. 5-1. 5小时。所述待培养终止加入显色液终止酶促反应并显色，是将底物培养后待测定土壤中加入2mL的显色液，摇匀显色20 - 30min后过滤，取上清液在415nm下测定吸光度。所述显色液为钥酸铵溶液(100g L—1)、钒酸铵溶液(2. 35g L—1)和稀硝酸(浓硝酸水=1:2的混合液，所述钥酸铵溶液、钒酸铵溶液和稀硝酸按体积比为1:1:2的混合。本专利技术具有以下优点I.本专利技术采用甲苯抑制土壤中的微生物活性，控制了土壤微生物在对植酸酶活性测定过程中的影响。2.本专利技术直接将土壤进行培养，调节植酸酶最适pH以及最适温度，使土壤中的植酸酶活性得到最真实的表达。3.本专利技术采用终止/显色液，既是酶促反应终止液，又是产物反应液，同时颜色反应不受温度和时间限制，操作稳定可靠。附图说明图I为本专利技术实施例提供的不同土壤植酸酶活性特征图。 具体实施方式 本专利技术采用甲苯抑制土壤中的微生物活性，从而控制微生物活动对酶活测定的影响；然后，在土壤中加入pH5. 5的乙酸缓冲液，再加入底物植酸钠进行培养；培养后加入终止/显色液，终止反应并显色，在415nm下测定吸光度即可获得土壤植酸酶活性。具体方法详述如下I)甲苯杀死微生物以及底物培养称取I. OOg鲜待测土倒入50mL三角瓶中，用移液枪小心加入O. 2mL甲苯，迅速塞上瓶塞(注意试验防护，甲苯有毒)。向处理过的土壤样品中加入4mL0. 25mol Γ1 ρΗ5. 5的乙酸缓冲液，摇匀后，再加入2mL浓度O. 00761mol Γ1的植酸钠溶液，轻摇混匀后塞上瓶塞放入恒温培养箱内在30-40°C条件下培养O. 5-1. 5小时。其中，O. 25mol Γ'ρΗδ. 5的乙酸缓冲液是将34. 02g三水乙酸钠和I. 24mL浓盐酸加去离子水，用冰醋酸和氢氧化钠调PH值至5. 50定容至IOOOmL(现配现用);植酸钠溶液是称取7. 81g质量纯度为90%植酸钠加入乙酸缓冲液用冰乙酸或氢氧化钠调pH至5. 5后定容至IOOOmL(现配现用)。在实验过程中需设置对照组实验，用以消除土壤的本底值对试验数据的影响，即在操作过程中用2mL乙酸缓冲液代替植酸钠溶液，其他操作同实验组。2)终止/显色测定将经过步骤I)培养后的样品取出，迅速加入2mL的终止/显色液，摇匀显色20-30min后用定性滤纸过滤,取滤液在415nm下测定吸光度。其中，终止/显色液是体积比为钥酸铵溶液(钥酸铵溶液浓度为IOOg Γ1):钒酸铵溶液(钒酸铵溶液2.358^):稀硝酸(稀硝酸由浓硝酸和水体积比，浓硝酸水=1:2) =1:1:2的混合液。3)植酸酶活性计算公式酶活(FTU/g)={(P-P0) XV}/ (mXh)式中P----测定实验组总憐量/ U mo I P0――测定对照组总磷量/ μ molV——所加溶液总体积/mLm——干土重量/gh----培养时间/小时酶活单位μmol Pireleased g_1 dry soil tf1。实施例I采集不同土壤(黑土、褐土和棕壤)鲜土,过2mm筛后各称取I. OOg于50mL三角瓶中，加入O. 2mL甲苯，4mL缓冲溶液，2mL植酸钠溶液，轻摇混匀塞上瓶塞在37° C下培养I小时，取出，加入2mL终止/显色液，摇匀，显色20min，过滤，取滤液在415nm下测定吸光度，即可计算得到土壤植酸酶活性。其中，O. 25moir1 pH5. 5的乙酸缓冲液是将34. 02g三水乙酸钠和I. 24mL浓盐酸加去离子水，用冰醋酸和氢氧化钠调pH值至5. 50定容至IOOOmL (现配现用)；植酸钠溶液是称取7. 81g90%植酸钠加入乙酸缓冲液用冰乙酸或氢氧化钠调pH至5. 5后定容至IOOOmL(现配现用)利用紫外分光光度计测定实施例I不同土壤(黑土、褐土和棕壤)植酸酶活性并进行运算结果(见图I)。由图I可知，植酸酶活性在黑土中为5. 2 μ mol Pireleased g_1drysoil h \ 揭土为 6· I μ mol Pi released g 1 dry soil h \ 掠壤为 I. 3 μ mol Pi releasedg_1dry soil IT1。各土壤植酸酶活性之间存在一定的差异,表明该方法能够用来直接测定且准确表达不同土壤的植酸酶活性特征。 实施例2采集白衆土表层0-20cm鲜土,过2mm筛后称取I. OOg于50mL三角瓶中，加入0. 2mL甲苯，4mL缓冲溶液，2mL植酸钠溶液，轻摇混匀塞上瓶塞在35° C下培养I. 5小时，取出，力口入2mL终止/显色液，摇匀，显色30min，过滤，取滤液在415nm下测定吸光度，即可计算得到土壤植酸酶活性。其中，0. 25mol L—1 pH 5. 5的乙酸缓冲液是将34. 02g三水乙酸钠和I. 24mL浓盐酸加去离子水，用冰醋酸和氢氧化钠调pH值至5. 5本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种直接测定土壤植酸酶活性的方法，其特征在于：将甲苯加入到待测定土壤中，而后进行底物培养在待测土壤中加入pH5.5的乙酸缓冲液、植酸钠；待培养终止加入显色液终止酶促反应并显色，显色后在415nm下测定显色液吸光度，即可获得土壤植酸酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张艾明，陈振华，陈利军，梁文举，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：
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