用于试样的图像显示方法及其光学显微设备技术

本发明专利技术描述了一种用于试样(16)图像显示的方法和设备。通过借助于成像光学系统(40)使样试(16)在图像传感器(28)上成像，而摄取单一图像序列。为了每个单一图像的摄取均对试样(16)提供了标记物结构，在所述标记物结构中，单一标记物借助于成像光学系统(40)以空间可相互分开的光分布(82)的形式在图像传感器(28)上成像。确定所述光分布(82)的重心位置(84、86、88)，并重叠成该试样(16)的全图。按本发明专利技术，在摄取单一图像序列期间测量引起图像偏移的温度数值(△T1、△T2、…,△Tn)。按预定的分配数据(400)将取决于温度的偏移数值(△X1、△X2、…,△Xn；△Y1、△Y2、…,△Yn)分配给引起图像偏移的温度数值(△T1、△T2、…,△Tn)。按偏移数值(△X1、△X2、…,△Xn；△Y1、△Y2、…,△Yn)校正所确定的重心位置(84、86、88)。

【技术实现步骤摘要】
用于试样的图像显示方法及其光学显微设备
本专利技术涉及一种应用权利要求1的前序部分的光学显微设备以进行试样图像显示的方法。本专利技术还涉及一种根据权利要求9的前序部分的光学显微镜设备。
技术介绍
近来研发了光学显微成像方法，通过所述方法，试样能够基于单一标记物，特别是荧光分子的有序的、随机的定位而被显示，所述试样比常规的光学显微镜的基于衍射的分辨极限更小。例如在文献WO2006/127692A2；DE102006021317B3；WO2007/12843A1；US2009/0134342A1；DE102008024568A1；“Sub-diffraction-limitimagingbystochasticopticalreconstructionmicroscope(STORM)”，NatureMethods3,793-796(2006)，M.J.Rust,M.Bates,X.Zhuang；“ResolutionofLambda/10influorescencemicroscopyusingfastsinglemoleculephoto-switching”，GeislerC.etal,Appl,Phys.A,88,223-226(2007)中描述了这类方法。这种新的显微术分支也称为定位显微术。在文献中，所述应用的方法以如下标记被公开，例如：(F)PALM((Fluorescence)PhotoactivationLocalizationMicroscopy（荧光）光敏定位显微镜),PALMIRA(PALMwithIndependentlyRunningAcquisition具独立运行采集器的PALM),GSD(IM)(GroundStateDepletionIndividualMoleculereturn)Microscopy基态损耗（单分子返回）显微镜)或(F)STORM((Fluorescence)StochasticOpticalReconstructionMicroscopy（荧光）随机光重建显微镜)。这类新方法的共同点在于利用标记物处理待成像的试样，所述标记物具有两种状态，即“亮”态和“暗”态。例如当使用荧光染料作为标记物时，则亮态是能发荧光的状态，而暗态是不能发荧光的状态。为了以比成像光学系统的常规分辨极限更高的分辨率对试样进行成像，就要使小部分量的标记物重复转变成亮态。该“活性”的部分量形成标记物结构，其各个转变成亮态的标记物相互之间的平均间距大于成像光学系统的分辨极限。该各标记物结构在空间分辨图像传感器上成像，该图像传感器以检测在空间上相互可分开的光分布的形式来检测该各标记物。以此方法摄取大量单一图像，在这些单一图像中总是成像有另一种标记物结构。在图像分析过程中由此确定每个单一图像中所述光分布的重心位置，该重心位置显示了处于亮态的标记物。将由原始数据-单一图像测算出的光分布的重心位置以全图形式汇总到总图示中。通过该总图示产生的高分辨率的全图反映出标记物的分布。为了有代表性地重现该待测试样，必须探测到足够多的标记物信号。但是，因为在各活性标记物结构中标记物的数目被处于亮态的两标记物相互间所必需的最小平均间距所限，所以需摄取非常多的单一图像，以使该试样充分成像。通常单一图像的数目为10000-100000。摄取单一图像所需的时间的下限被该图像传感器的最大图像摄取速率所限。这导致了用于总图示所需的单一图像序列的总摄取时间相对较长。因此所述总摄取时间可达数小时。在这样长的总摄取时间内，会产生导致待成像试样相对于成像光学系统发生偏移的热效应，例如光显微镜机械部件的热膨胀、收缩或应变。由于为了完成高分辨率的全图而按重心规定汇总所有的单一图像，所以在摄取两个相继的单一图像时出现的试样和成像光学系统之间的所有相对移动均恶化该全图的位置分辨率。上述的问题可在下面按附图1至4阐明。图1示出常规的倒置光学显微镜10的简图。该倒置光学显微镜10具有支架12，其上安置有载物台14。在载物台14上安置试样固定件15，待成像的试样16布置在所述试样固定件上。该试样16由配置在载物台14上方的光源17照射。所述光源17安装在旋转臂18上。在该旋转臂18上还安置有固定件20，所述固定件包括多种在图1中未示出的光学系统，该光学系统用于实现不同的照射模式，例如标准的透射光照射或相对比照射。为此，将在该固定件20中为各个照射模式提供的光学系统转摆至图1中用22表示的照射光径中。由光源17提供的照射光经安装在该固定件20背面的聚光镜23导向试样16。为便于对试样16的操作，所述旋转臂18可与上面提及的光学系统一起从载物台14上脱开。在载物台14下方设置有电动的物镜旋转台24，所述物镜旋转台上安装有多个物镜26。所述物镜26能够通过物镜旋转台24围绕图1中用O表示的光轴O的旋转，选择性地转摆到通过光轴O确定的成像光径中。所述恰好转摆到成像光径中的物镜26通过在载物台14中形成的贯通到图像传感器28上的通孔19使试样16成像。所述图像传感器28与控制图像传感器28的传感器驱动器29相连，此外，该传感器驱动器29将通过图像传感器28接收的传感器信号生成为用于进一步图像处理的图像信号。所述显微镜支架12与控制设备30如电子计算机相连接，通过所述控制设备能够对显微镜功能和尤其是图像处理进行控制。对此所述控制设备30接收由传感器驱动器29生成的图像信号。所述控制设备30与监视器32相连，在所述监视器上显示出根据处理后的图像信号所生成的试样图像。该试样图像还可经目镜34观察。在图1的光学显微镜10中，物镜旋转台24安装在U-形支架12上，以致在成像物镜26和试样16之间的图像偏移相关距离(image-drift-relevantdistance)是相对较大的。这样，所述试样16通过试样固定件15、载物台14、U-形支架12和物镜旋转台24与物镜26相连。由于该较大的距离，图1的光学显微镜10特别易于受热不稳定性的影响，所述热不稳定性似乎随所述距离而增加。这种热不稳定性能够由环境空气中或光学显微镜10本身的温度波动引起的，或许由受热的电子构件引起。所述温度波动导致例如由金属制成的、使试样16和物镜26保持定位的构件通过热膨胀或收缩而改变其尺寸，由此可导致试样16和物镜26的相对移动。以下的测评表明，这种热不稳定性在所达到的分辨率通常低于20nm的高分辨率定位显微术领域中是如何重要。铝作为通常在制造金属的显微镜构件中所使用的材料，其热膨胀系数为23·10-6K-1。如果示例性地假定，在图1所示的光显微镜10中，试样16与物镜26相连的图像偏移相关距离为10cm，且该距离由铝制成的显微镜构件确定，则每K温度变化产生的机械偏移约为2.3μm。如果将该温度变化与上述的空间分辨率相关联，则直接显示出，温度波动可大大损害成像质量。对于图1所示的光显微镜10，例如在由电子构件构成的传感器驱动器29中存在可引起偏移的热源，该热源使支架12受热。同样这也适用于例如用于旋转物镜旋转台24的电动构件。此外，光源17以及存在于固定件20中的许多机械执行元件也产生热，所述热对成像准确性也是有害的。为避免由热引起的偏移，在文献WO2004/034124A1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用光学显微设备(100)以用于试样(16)图像显示的方法，所述光学显微设备包括成像光学系统(40)和图像传感器(28)，所述方法包括下列步骤：通过借助于成像光学系统(40)对试样(16)的连续成像，在图像传感器(28)上摄取单一图像的序列，其中对每个单一图像的摄取均为试样(16)提供标记物结构，在所述标记物结构中，各标记物可借助于成像光学系统(40)以空间上可相互分开的光分布(82)形式在图像传感器(28)上成像，确定该光分布(82)的重心位置(84、86、88)，所述重心位置在各单一图像中显示所成像的标记物，和将确定的重心位置(84、86、88)重叠成试样(16)的全图，其特征在于，在摄取单一图像序列期间测量引起图像偏移的温度数值(△T1、△T2、…,△Tn)，按预定的分配数据(400)将温度相关的偏移数值(△X1、△X2、…,△Xn；△Y1、△Y2、…,△Yn)分配给引起图像偏移的温度数值(△T1、△T2、…,△Tn)，并且按偏移数值(△X1、△X2、…,△Xn；△Y1、△Y2、…,△Yn)校正所确定的重心位置(84、86、88)。

【技术特征摘要】
2011.06.22 DE 102011051278.01.一种应用光学显微设备(100)以用于试样(16)图像显示的方法，所述光学显微设备包括成像光学系统(40)和图像传感器(28)，所述方法包括下列步骤：通过借助于成像光学系统(40)对试样(16)的连续成像，在图像传感器(28)上摄取单一图像的序列，其中对每个单一图像的摄取均为试样(16)提供标记物结构，在所述标记物结构中，各标记物可借助于成像光学系统(40)以空间上可相互分开的光分布(82)形式在图像传感器(28)上成像，确定该光分布(82)的重心位置(84、86、88)，所述重心位置在各单一图像中显示所成像的标记物，和将确定的重心位置(84、86、88)重叠成试样(16)的全图，其特征在于，在摄取单一图像序列期间测量引起图像偏移的温度数值(△T1、△T2、…,△Tn)，按预定的分配数据(400)将温度相关的偏移数值(△X1、△X2、…,△Xn；△Y1、△Y2、…,△Yn)分配给引起图像偏移的温度数值(△T1、△T2、…,△Tn)，按偏移数值(△X1、△X2、…,△Xn；△Y1、△Y2、…,△Yn)校正所确定的重心位置(84、86、88)，并且在摄取代表单一图像序列的原始数据之后根据校正的重心位置形成试样的无偏移的完整定位显微图像。2.根据权利要求1的方法，其特征在于，由实验确定所述分配数据(400)，并存储在光学显微设备(100)中。3.根据权利要求2的方法，其特征在于，提供具有至少一个参比标记物的参比结构，用于确定分配数据(400)，将引起图像偏移的温度数值设置为多个参比温度值，为每个参比温度值摄取该参比结构的参比单一图像，其中，借助于成像光学系统以参比光分布形式使该参比结构的参比标记物在图像传感器上成像，为每个参比温度值确定其所属的参比光分布的参比重心位置，由参比重心位置依赖于参比温度值的变比来确定与温度相关的偏移数值。4.根据上述权利要求中任意一项的方法，其特征在于，测量该光学显微设备(100)的至少一个构件(12、14、42)的温度作为引起图像偏移的温度数值(△T1、△T2、…、△Tn)。5.根据权利要求4的方法，其特征在于，对在载物台(14)内部或其表面上的温度，和/或在为成像光学透镜(40)提供的固定件设备(42)内部或其表面上的温度，和/或在其上放置载物台(14)的支架(12)内部或其表面上的温度进行测量。6.根据权利要求1的方法，其特征在于，将该测得的温度数值(△T1、△T2、…,△Tn)转换成惰性补偿值，并按转换过的温度数值确定偏移数值(△X1、△X2、…,△Xn；△Y1、△Y2、…,△Yn...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·弗林格，
申请(专利权)人：徕卡显微系统复合显微镜有限公司，
类型：发明
国别省市：