本发明专利技术属实验方法领域，涉及一种用体外细胞培养方式鉴定“肾主骨”效应的测定方法。该方法应用体外细胞培养的方式，将肾小球系膜细胞直接作用于成骨细胞，在细胞水平观察两者的内在联系。经实验结果表明，本方法有效地避免了体内复杂的影响因素，将肾小球系膜细胞直接作用于成骨细胞，并在细胞水平观察两者内在联系，证实肾系膜细胞能直接作用于成骨细胞，促进成骨细胞增殖；肾系膜细胞能直接作用于成骨细胞，促进成骨细胞分泌AKP。本发明专利技术的实验结果为“肾主骨”的中医理论提供了更直接及客观确切的现代科学理论依据。本发明专利技术方法还可用于制备成骨细胞培养液。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属实验方法领域，涉及体外细胞培养的测定方法，具体涉及一种。该方法应用体外细胞培养的方式，将肾小球系膜细胞直接作用于成骨细胞，在细胞水平观察两者的内在联系。本专利技术还包括建立该方法的步骤和其应用领域。
技术介绍
中医理论认为，肾藏精。精,是构成人体和维持人体生命活动的最基本物质。精生髓，髓居于骨中，促进骨的生长发育，故肾具有“主骨生髓”的功能。中医古 籍中记载“肾生骨髓”(《素问·阴阳应象大论》)、“肾主身之骨髓”(《素问·痿论)、肾“其充在骨”(《素问·六节脏象论》)。《圣济总录 诸痹门》大力提倡“补肝肾以壮骨”，强调补肾填精药对骨及骨关节疾病的作用。目前，临床上多用补肾中药治疗多种骨代谢疾病。当前对“肾主骨”现代机制进行的研究，主要从钙磷代谢、激素(如活性维生素03)、细胞因子(如骨形态发生蛋白BMP7)及神经内分泌等方面，间接证实“肾主骨”的现代理论依据。中医所说的肾是从功能上定义，包括了现代医学上的人体器官一肾脏，肾脏是“肾主骨”理论体系的主要器官。胚胎学等方面的研究证实，肾与骨均发生于中胚层，属于同源器官；肾小球系膜细胞是肾小球的主要固有细胞之一，具有分泌多种生物活性物质的功能；成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞，是骨形成过程中的重要功能细胞，其主要功能是分泌骨基质，不仅与骨的形成密切相关，且在骨吸收过程中也起关键性作用；所述的成骨细胞对骨组织的生长发育、骨代谢平衡、骨量维持和损伤修复起关键作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，该方法应用体外细胞培养的方式，将肾小球系膜细胞直接作用于成骨细胞，在细胞水平观察两者的内在联系。所述的方法能鉴定肾小球系膜细胞直接作用于成骨细胞的效应，为证实中医“肾主骨”的理论提供现代科学理论依据。本专利技术还提供了建立所述方法的步骤及其用途。本专利技术的，是将源于实验幼鼠的成骨细胞，在含有实验大鼠肾小球系膜细胞培养上清液的培养液中培养后，测定经培养的成骨细胞的增值及碱性磷酸酶的浓度，在细胞水平分析所述成骨细胞和肾小球系膜细胞的内在联系，鉴定“肾主骨”效应。本专利技术的一个实施例中将取于幼鼠的成骨细胞分成两组，一组用含有正常大鼠血清的培养液培养，另一组用含有大鼠肾的系膜细胞培养后的培养液上清去培养；在培养的第一、第二、第三、第五天检测成骨细胞的增值情况，以及在第三天检测培养上清液的碱性磷酸酶浓度，了解成骨细胞的生长及功能的变化；实验结果显示，用含有大鼠肾的系膜细胞培养后的培养液上清培养的成骨细胞能促进成骨细胞的生长分化及功能；表明所述的体外细胞培养的方法能为证实中医“肾主骨”的理论提供直接简单明了的现代科学理论依据。具体而言，本专利技术的，其特征在于，其包括步骤(I)分离培养实验大鼠肾小球系膜细胞，所得肾小球系膜细胞免疫组化法鉴定为抗结蛋白抗体阳性、抗细胞角蛋白抗体阴性；(2)提取分离成骨细胞，所得成骨细胞鉴定结果显示显微镜下见细胞贴壁生长呈三角形、纺锤形和多角形等多种形态，培养3 5天，细胞体积增大，见较多细胞分裂相；胞浆丰富，向外伸展，伸出多个突起，与周围细胞的突起相互连结；培养I周左右，细胞融合，多呈立方形；行碱性磷酸酶染色，倒置相差显微镜下观察细胞的细胞核及细胞质上形成了灰黑至深黑色颗粒状或片 状沉淀；(3)分组培养成骨细胞，先用无血清培养液培养24h，然后分为正常血清组和系膜细胞组，正常血清组予含10%的正常大鼠血清RPMI-1640培养液；系膜细胞组予含20%的系膜细胞上清液的正常大鼠血清RPMI-1640培养液；(4)制备培养液；正常血清组培养液SD雄性大鼠常规取血，离心，收集上清液，-20°C冷藏，使用前4°C解冻过夜，56°C水浴灭活，过滤除菌，用RPMI-1640培养液稀释至10% ；系膜细胞组培养液取第3代系膜细胞接种培养瓶中，每周3次换液至细胞铺占瓶底约80%，换用含10%的正常小鼠血清RPMI-1640培养液，继续培养，取上清备用，使用时用正常血清组培养液稀释至20% ；(5)采用成骨细胞增殖(MTT法)、碱性磷酸酶(ELISA法)，测定观察指标，在酶标仪上检测成骨细胞光密度(OD)值，检测波长490nm ；ELISA法测定碱性磷酸酶，在450nm处测吸光值；所有计量资料采用均数土标准差(X土 s)表示，利用SPSS15. O软件进行统计分析，采用单因素方差分析，应用Levene检验进行方差齐性检验，P < O. 05为差异有统计学意义。经测定，结果显示(I)所述的系膜细胞组和正常血清组的成骨细胞的增殖均随时间而逐步增加，表明肾系膜细胞能直接作用于成骨细胞，促进成骨细胞的增殖；(2)所述的系膜细胞组的第三天AKP的浓度浓度明显高于正常血清组30. 5%，P< O. 05，表明肾系膜细胞能直接作用于成骨细胞，促进成骨细胞分泌AKP。表I是成骨细胞增殖的OD值(η = 8)。表2是成骨细胞第三天分泌AKP的浓度(η = 8)。表I权利要求1.，其特征在于，将源于实验幼鼠的成骨细胞，在含有实验大鼠肾小球系膜细胞培养上清液的培养液中培养后，测定经培养的成骨细胞的增值及碱性磷酸酶的浓度，在细胞水平分析所述成骨细胞和肾小球系膜细胞的内在联系，鉴定“肾主骨”效应。2.按权利要求I所述的测定方法，其特征在于，该方法包括步骤 (1)分离培养实验大鼠肾小球系膜细胞， (2)提取分离成骨细胞， (3)分组培养成骨细胞， (4)制备正常血清组培养液和系膜细胞组培养液， (5)采用成骨细胞增殖和碱性磷酸酶，测定、分析观察指标。3.按权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(I)所得肾小球系膜细胞免疫组化法鉴定为抗结蛋白抗体阳性、抗细胞角蛋白抗体阴性。4.按权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(2)所得成骨细胞为显微镜下细胞贴壁生长呈三角形、纺锤形和多角形形态，培养3 5天，细胞体积增大，较多细胞分裂相；胞浆丰富，向外伸展，伸出多个突起，与周围细胞的突起相互连结；培养I周，细胞融合，呈立方形；碱性磷酸酶染色显示细胞核及细胞质上形成灰黑至深黑色颗粒状或片状沉淀。5.按权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中，先用无血清培养液培养成骨细胞24h，然后分为正常血清组和系膜细胞组，正常血清组含10%的正常大鼠血清RPMI-1640培养液；系膜细胞组含20%的系膜细胞上清液的正常大鼠血清RPMI-1640培养液。6.按权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(4)中的正常血清组培养液通过下述方法制备取SD雄性大鼠血，离心，收集上清液，-20°C冷藏，使用前4°C解冻过夜，56°C水浴灭活，过滤除菌，用RPMI-1640培养液稀释至10% ;所述的系膜细胞组培养液通过下述方法制备取第3代系膜细胞接种培养瓶中，每周3次换液至细胞铺占瓶底约80%，换用含10%的正常小鼠血清RPMI-1640培养液，继续培养，取上清备用，使用时用正常血清组培养液稀释至20%。7.按权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(5)中， 在酶标仪上检测成骨细胞光密度值，检测波长490nm ； ELISA法测定碱性磷酸酶，在450nm处测吸光值。8.按权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述的肾系膜细胞直接作用于所述的成骨细胞，促进成骨细本文档来自技高网...
【技术保护点】
用体外细胞培养方式鉴定“肾主骨”效应的测定方法，其特征在于，将源于实验幼鼠的成骨细胞，在含有实验大鼠肾小球系膜细胞培养上清液的培养液中培养后，测定经培养的成骨细胞的增值及碱性磷酸酶的浓度，在细胞水平分析所述成骨细胞和肾小球系膜细胞的内在联系，鉴定“肾主骨”效应。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何立群，林日阳，吴锋，
申请(专利权)人：上海中医药大学附属曙光医院，
类型：发明
国别省市：
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