小金海棠MxVHA-c蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了小金海棠MxVHA-c蛋白及其编码基因与应用。本发明专利技术所提供的小金海棠MxVHA-c蛋白是如下（a）或（b）的蛋白质：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐缺铁相关的由（a）衍生的蛋白质。本发明专利技术所提供的MxVHA-c对于缺铁胁迫的植株具有很重要的调节作用，本发明专利技术为进一步研究小金海棠的耐缺铁性提供了很好的理论依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及小金海棠MxVHA-C蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
铁元素是植物生长必需的营养元素之一。植物缺铁会引起叶片黄化、早衰、光合作用下降等现象，严重者造成作物产量与品质下降。农业生产缺铁是一个世界性的问题，世界各国都有大量有关植物缺铁的报道。因此，需要发展有效的抗缺铁的办法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因。 本专利技术所提供的与植物耐缺铁相关的蛋白，名称为MxVHA-c，来源于苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis),是如下Ca)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列I的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐缺铁相关的由(a)衍生的蛋白质。其中，序列表中的序列I由166个氨基酸残基组成。为了使I)中的MxVHA-c便于纯化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。表I标签的序列标签__残基__序歹Li_ ~ Poly-Arg_^6(通常为 5 个) —RRRRR ~Poly-His~10 (通常为 6 个) ^HHHHHH ~FLAG~8~~DYKDDDDK _ Strep-tag II ~8~~WSHPQFEK ~ c-myc10EQKLISEEDL上述2)中的MxVHA-c可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的MxVHA-c的编码基因可通过将序列表中序列2的自5'末端第1-498位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表I所示的标签的编码序列得到。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。所述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因I)序列表中序列2自5’末端起第I位-498位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)所不的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。上述序列表中的序列2由498个核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自5'末端第1-498位脱氧核苷酸，编码的氨基酸序列如序列表中的序列I所示。含有所述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。所述重组表达载体是在pYES2. 0载体的多克隆位点间插入所述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体。本专利技术的另一个目的是提供一种获得重组酵母菌的方法。本专利技术所提供的获得重组酵母菌的方法，为如下I)或2)所示I)将与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因导入出发酵母菌中，得到V型H+-ATPase酶活性增高的重组酵母菌； 2)将与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因导入出发酵母菌中，得到耐Cd2+毒害能力增强和/或耐缺铁能力增强的重组酵母菌。所述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因是通过酵母表达载体导入出发酵母菌中。所述出发酵母菌为野生型酵母菌株BJ2168 (Saccharomyces cerevisiae)。根据所述方法获得的重组酵母菌也属于本专利技术的保护范围。上述任一所述蛋白或其编码基因在培育耐缺铁植物中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的又一个目的是提供一种培育耐缺铁能力增强的转基因植物的方法。本专利技术所提供的培育耐缺铁能力增强的转基因植物的方法，是将上述蛋白的编码基因导入出发植物中，得到耐缺铁性能增强的转基因植物。所述出发植物为双子叶植物，具体为拟南芥。本专利技术所提供的小金海棠MxVHA-c蛋白及其编码基因MxVHA-c对于缺铁胁迫的植株来说有很重要的调节作用，本专利技术所用的材料小金海棠在是一种耐缺铁的植株，它是一种典型的机理I植物，即植物必须可以通过激活质膜上的H+-ATPase,使土壤酸化，增加铁的可溶性。然后在三价铁还原酶的作用下将三价铁还原成二价铁，在质膜上的二价铁转运蛋白的作用下转运进细胞质中，增加植株的耐缺铁性。本专利技术所提供的MxVHA-c基因对于缺铁胁迫的植株具有很重要的调节作用，本专利技术为进一步研究小金海棠的耐缺铁性提供了很好的理论依据。附图说明图I为MxVHA-c基因的PCR扩增产物结果。图2为不同铁处理水平下MxVHA-c基因在小金海棠不同器官中的荧光定量PCR结果。图3为MxVHA-c基因瞬时表达载体pEZS-MxVHA_c的酶切鉴定结果。图4为MxVHA-c基因的亚细胞定位检测结果。图5为酵母表达载体pYES2. 0-MxVHA-c-GFP的酶切结果。图6为转基因酵母的PCR鉴定结果。图7为转基因酵母中V型H+-ATPase酶活的测定。图8为转基因酵母在40 ii M Ferrozine处理情况下的生长情况。图9为转基因酵母在10 ii M CdCl2处理情况下的生长情况。图10为转基因株系的PCR鉴定图11为转基因拟南芥在缺铁情况下的生长情况。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、与植物耐缺铁相关蛋白MxVHA-c及其编码基因的获得一、MxVHA-c基因全长的获得 以小金海棠(Malus xiaojinensis)(公众可从中国农业大学获得,记载过该小金海棠的非专利文献是成明昊，李晓林，张云贵，苹果优良砧木资源-小金海棠，西南农业大学学报，2000年10月，22(5):383-386)为实验材料，提取其叶片总RNA，将其反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以引物Fl (序列表中序列3)和引物Rl (序列表中序列4)为引物对引物Fl AAAGAATTCATGTCTTCTTCAACCTTC,下划线部分表示酶切位点 EcoRI，引物Rl AAAGTCGACCCCTCAGCTCTTGACTGACC,下划线部分表示酶切位点 Sail,进行PCR扩增，反应体系中使用高保真的HiF mix,以确保扩增的特异性。PCR扩增反应体系如下ddH20^OjlII2xHiF Mix (0.5U/|.il)IOfJF (IOmM)1.0 [i\R (IOmM)1.0模板(反转录的cDNA) 1.0 ix\Total20 jjPCR反应条件先94°C预变性3min ;然后94°C变性40S，58°C退火40S，72°C延伸lmin，共30个循环；最后72°C延伸IOmin0取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图I中A所示，其中，泳道M为2000bp的DNA分子量标准，泳道I和泳道2为PCR扩增产物。结果表明得到498bp的目的片段。切下目的条带，纯化回收后按照pEASY-Tl sample-Vector Kit载体试剂盒(购自全式金生物公司)说明书将PCR产物连接到载体pEASY-Tl sample (购自全式金生物公司)上，经Sail和EcoRI酶切验证后进行测序。酶切验证结果如图B所示泳道M为1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白，是如下（a）或（b）的蛋白质：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐缺铁相关的由（a）衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
2011.09.16 CN 201110275034.81.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列I的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐缺铁相关的由(a)衍生的蛋白质。2.权利要求I所述蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下I)-4)中任一所述的基因 1)序列表中序列2自5’末端起第I位-498位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 4)与I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩振海，张倩，张新忠，王忆，陈峰，吴婷，许雪峰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：