一种膜培养筛选鸟苷高产菌的方法技术

本发明专利技术涉及一种鸟苷高产菌筛选的方法，包括有以下步骤：1）将待筛选和复壮的鸟苷生产菌加入灭菌蒸馏水，置振荡器上，混合均匀，制成稀释度为10-2-10-7的菌悬液；2）将菌悬液接种至膜培养系统中，静置培养；3）根据膜培养系统中鸟苷生产菌的菌落大小和形态进行判断，初筛出鸟苷高产菌株和负变菌株。本发明专利技术的有益效果在于：通过此方法筛选到的鸟苷高产菌，摇瓶培养产苷达18-20g/L。该方法新颖，实施简便，筛选准确率远高于传统筛选方法，对于工厂高产菌株日常的分离，筛选工作起到了提高效率，增加准确率和减少工作量的优化作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，具体来说是一种鸟苷(Guanosine)高产菌筛选的方法。
技术介绍
鸟苷又名鸟嘌呤核苷或9-( P -D-呋喃核糖基)鸟嘌呤(9-(3 -D-Ribofuranosyl)guanine 鸟嘌呤-9-0 -D-呋喃核糖苷(Guanine-9-0 -D-ribofuranoside)。鸟苷的用途十分广泛，可用于合成食品增鲜剂一5’ -鸟苷酸二钠、呈味核苷酸二钠以及作为医药产品的重要中间体，可形成一系列的下游医药产品，包括核苷类抗病毒药物如利巴韦林、阿昔洛韦等，也是用于制造无环鸟苷(Acyclovir)、三氮唑核苷(ATC)、三磷酸鸟苷钠(GTP)等药物的主要原料。小西等人，通过解除MP脱氢酶的反馈抑制，选育的抗8-氮鸟嘌呤等突变株，把肌苷生产株变为具有产鸟苷能力的突变株；松井等人由枯草芽孢杆菌为出发菌株，诱导具 有甲硫氨酸亚砜突变株，进一步提高鸟苷的产量；Hiroshi Matsui等人进一步筛选出具有阿洛酮糖素抗性和德夸菌素抗性的突变株，增大了鸟苷的积累。但由于鸟苷生产菌是缺陷性生产菌株，在保藏，生产，传代过程中鸟苷高产菌株不可避免的发生负变，造成鸟苷的产量下降，必须进行定期的筛选和复壮。但传统的稀释涂平板法但从菌落形态上很难分辨出高产和负变菌株，初筛很盲目，增大了工作量，而准确度不高，造成筛选周期长，重复工作等弊病。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术而提出，该方法可以应用在鸟苷的大规模工业生产中，快速准确地进行鸟苷高产菌的筛选和复壮。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案是，包括有以下步骤 1)将待筛选和复壮的鸟苷生产菌加入灭菌蒸馏水，置振荡器上，混合均匀，制成稀释度为KT2-KT7的菌悬液； 2)将菌悬液接种至膜培养系统中，静置培养； 3)根据膜培养系统中鸟苷生产菌的菌落大小和形态进行判断，初筛出鸟苷高产菌株和负变菌株。按上述方案，所述的膜培养系统由三部分组成，培养皿的底层为步骤I)所述的菌悬液混匀的营养成分不丰富的琼脂培养基，中层为微孔滤膜，上层为浸润了营养丰富的培养液的灭菌滤纸。按上述方案，所述的微孔滤膜孔径为0. 02 ii m,直径为V85mm的聚碳酸酯微孔滤膜。按上述方案，所述的营养成分不丰富的琼脂培养基为双酶糖30±5 g/L，蛋白胨1±0.5 g/L，磷酸二氢钾4±0.5 g/L，硫酸铵6±2g/L，氯化钠1±0. 5 g/L，碳酸钙20±5g/L和硫酸镁3±2 g/L。按上述方案，所述的营养成分丰富的的培养液为酵母粉35±5 g/L，酵母膏10±5g/L和玉米浆10±2 g/L。按上述方案，静置培养条件为28°C -38 °C，培养时间为30 h_44 h。按上述方案，膜培养系统的制备方法为待培养皿的底层的营养成分不丰富的琼脂培养基凝固，培养6 h-8 h后，在其上置一层灭菌的聚碳酸酯微孔滤膜，其上层再布置浸润了营养丰富的培养液的灭菌滤纸，于28°C -38°C继续培养22 h_36 h。按上述方案，步骤3)中的判断方法是膜培养系统中同样条件下生长快，菌落大而润泽的单菌落，为负变菌株，产苷量较低；生长较慢，菌落小而干燥的单菌落，为高产菌株。 按上述方案，初筛后还包括进一步复筛，通过将筛选出的高产菌株和负变菌株接入摇瓶，28°C-38°C，转速200 rpm-300 rpm，培养30 h_48 h，取离心后，清液采用HPLC法，准确测定鸟苷的产量。本专利技术的有益效果在于通过此方法筛选到的鸟苷高产菌，摇瓶培养产苷达18-20g/L。该方法新颖，实施简便，筛选准确率远高于传统筛选方法，对于工厂高产菌株日常的分离，筛选工作起到了提高效率，增加准确率和减少工作量的优化作用。附图说明图I为膜培养系统的结构示意 图2为应用实施例I鸟苷甘油保藏菌膜培养法筛选结果； 图3为应用实施例2鸟苷斜面保藏菌膜培养法筛选结果； 图4为应用实施例3鸟苷发酵菌液膜培养法筛选结果； 图5为应用实施例4鸟苷诱变后的菌株培养法筛选结果。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术做进一步详细的说明，但是此说明不会构成对本专利技术的限制。鸟苷的初筛 将待筛选的鸟苷生产菌加入一定量的灭菌培养基，置振荡器上，混合均勻，制成一定浓度梯度菌悬液，在培养皿的底层注入用菌悬液混匀的营养成分不丰富的琼脂培养基，待凝固后，接种至培养基中，静置培养6 h-8 h。再在培养基上层置一层灭菌的0.02 pm的聚碳酸酯微孔滤膜，滤膜的上层置浸润了营养丰富的培养液的灭菌滤纸，28°C -38°C，继续培养至30 h-44 h。根据培养系统中鸟苷生产菌的菌落大小和形态，初筛出鸟苷高产菌。膜培养系统中同样条件下生长快，菌落大而润泽的单菌落，为负变菌株，产苷量较低；生长较慢，菌落小而干燥的单菌落，为高产菌株。鸟苷的复筛 为了准确确定选出菌株的鸟苷生产能力，对初筛出的菌株进行进一步复筛，特征如下将筛选出的高产菌株和负变菌株接入摇瓶，28°C-38°C，转速200 rpm-. 300 rpm，培养30h-48 h。取离心后，清液采用HPLC法检测，HPLC法条件如下安捷伦HPLC (1100型)工作站(HP Chem station),色谱条件C18 柱(4. 6X 250mm, 10 u m);流动相乙腈-水(3:97),柱温30°C，流速I mL/min，进样量15iiL ;检测波长为260 nm。准确测定鸟苷的产量。并确定采用膜培养系统方法筛选的准确率。实施例I : ，包括有以下步骤将待筛选和复壮的鸟苷生产菌加入灭菌蒸馏水，置振荡器上，混合均匀，制成稀释度为10_5的菌悬液；将菌悬液接种至膜培养系统中进行静置培养，静置培养条件为37°C，培养时间为40h ;根据膜培养系统中鸟苷生产菌的菌落大小和形态，初筛出鸟苷高产菌株和负变菌株，判断标准是膜培养系统中同样条件下生长快，菌落大而润泽的单菌落，为负变菌株，产苷量较低；生长较慢，菌落小而干燥的单菌落，为高产菌株。本专利技术所述的膜培养系统由三部分组成，如图1，培养皿的底层为菌悬液混匀的营养成分不丰富的琼脂培养基1，中层为微孔滤膜2，上层为浸润了营养丰富的培养液的灭菌滤纸3，所述的微孔滤膜为孔径为0. 02 u m，直径为u/85_的聚碳酸酯微孔滤膜，所述的营养成分不丰富的琼脂培养基为双酶糖30±5 g/L，蛋白胨1±0.5 g/L，磷酸二氢钾4±0.5 g/L，硫酸铵6±2g/L，氯化钠1±0. 5 g/L，碳酸钙20±5 g/L和硫酸镁3±2 g/L,所述的营养成分丰富的的培养液为酵母粉35±5 g/L，酵母膏10±5 g/L和玉米浆10±2g/L，其制备方法如下待培养皿的底层的营养成分不丰富的琼脂培养基凝固，培养7h后，在其上置一层灭菌的聚碳酸酯微孔滤膜，滤膜的上层再布置浸润了营养丰富的培养液的灭菌滤纸，于30°C继续培养30 h。初筛后还需进行进一步复筛，即将筛选出的高产菌株和负变菌株接入摇瓶，30°C，转速200 rpm-300 rpm,培养40h，取离心后，清液采用HPLC法，HPLC法条件如下安捷伦HPLC (1100 型)工作站(HP Chem station),色谱条件C18 柱(4. 6X 250mm, 10 y m);流动本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种膜培养筛选鸟苷高产菌的方法，包括有以下步骤：1）将待筛选和复壮的鸟苷生产菌加入灭菌蒸馏水，置振荡器上，混合均匀，制成稀释度为10？2？10？7的菌悬液；2）将菌悬液接种至膜培养系统中，静置培养；3）根据膜培养系统中鸟苷生产菌的菌落大小和形态进行判断，初筛出鸟苷高产菌株和负变菌株。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：程波，户业丽，
申请(专利权)人：武汉工程大学，
类型：发明
国别省市：