一种酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体及其应用。所述的紫穗槐二烯合酶突变体在保持催化产物不变的情况下，酶活性大大高于野生型。与传统方法相比，采用本发明专利技术的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体酶促生产青蒿素的效率高且成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及一种酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体及其应用。
技术介绍
青蒿素是中国科学家首次从青蒿(Artemisia annua)中分离鉴定的一种含过氧桥的倍半萜内酯，是目前最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物。以青蒿素为基础的综合疗法已受到世界卫生组织和西方国家的确认和推荐。青蒿中青蒿素含量低(0. 01-1 %干重)，且受品种和地域性种植影响大，资源紧缺。在青蒿素生物合成中，倍半職成分紫穗槐二烯(Amorphadiene, Amorpha-4,11-diene)由青蒿中的紫穗槐二烯合酶(amorpha-4,11-diene synthase ；ADS)催化 FPP 环化形成，它是青蒿酸和青蒿素生物合成的共同前体。增加紫穗槐二烯的产量可以促进青蒿酸和青蒿素的合成和积累。人工全合成青蒿素工艺复杂、成本高。因此，目前世界上青蒿素原料主要依靠从野生和栽培青蒿中直接提取。青蒿素生物合成途径研究近年来取得许多进展，已经克隆了紫穗槐二烯合酶(ADS)、青蒿酸合成酶(CYP71AV1)和青蒿醛还原酶Dbr2。科学家们利用代谢工程技术尝试通过微生物发酵合成青蒿素前体青蒿酸，然后通过有机半合成生产青蒿素，以降低青蒿素的生产成本。2006年，Jay Keasling对酵母菌进行了遗传工程改造，使之产生出高水平的青蒿酸。目前认为，利用微生物生产青蒿酸是一个切实可行的方法，可以降低青蒿素的生产成本。另外，也可以通过转基因植物过量表达青蒿素生物合成的相关基因，以期提高代谢产物的含量。发酵工程菌种的遗传改造需要将青蒿酸生物合成途径中的基因ADS和CYP701AV1整合到工程酵母或者工程细菌染色体中。并且，ADS的酶活性直接关系到青蒿酸的生物合成的产量。因此，如何有效地提高ADS的酶活性是本领域需要深入研究的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体及其应用。在本专利技术的第一方面，提供一种突变型紫穗槐二烯合酶，其对应于SEQ IDNO 2(野生型)氨基酸序列的第399位由苏氨酸突变为丝氨酸。在另一优选例中，该蛋白是(a)具有SEQ ID NO :3(突变型)所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-20个 ’较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO 3第399位位置的氨基酸为丝氨酸。在本专利技术的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组(i)编码所述的突变型紫穗槐二烯合酶蛋白的多核苷酸；或(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO 3所示氨基酸序列的多肽。在本专利技术的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的宿主细胞是酵母、细菌或植物细胞。更优选地，所述的宿主细胞是大肠杆菌。在本专利技术的另一方面，提供一种生产突变型紫穗槐二烯合酶的方法，包括步骤 (I)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和(2)从培养物中分离突变型紫穗槐二烯合酶。在本专利技术的另一方面，提供所述的突变型紫穗槐二烯合酶的用途，用于生产紫穗槐二烯和/或青蒿酸。在本专利技术的另一方面，提供一种生产紫穗槐二烯的方法，所述的方法包括利用所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)环化,从而获得紫穗槐二烯。在另一优选例中，所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化FPP环化在胞内或胞外进行。在另一优选例中，所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸环化在胞内进行，包括步骤将所述的突变型紫穗槐二烯合酶的编码基因转化入宿主细胞，培养该细胞，从而生产紫穗槐二烯。在另一优选例中，所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸环化在胞内进行，包括步骤将所述的突变型紫穗槐二烯合酶的编码基因以及法尼基焦磷酸产生酶(MVA/MEP途径中的酶；选自但不限于乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、IPP异构酶、5-磷酸-D-I-脱氧木酮糖合成酶5-磷酸-D-I-脱氧木酮糖还原异构酶、异戊烯二磷酸异构酶、5-磷酸-D-I-脱氧木酮糖合成酶、5-磷酸-D-I-脱氧木酮糖还原异构酶、4-磷酸-2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸合酶、2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸激酶、2C-甲基赤藓醇_2，4-焦磷酸合酶、I-羟基-2-甲基-2- 丁烯-4-焦磷酸合酶、I-羟基-2-甲基-2- 丁烯-4-焦磷酸还原酶、FPP合成酶、I-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶、HMG-CoA还原酶、香叶基转移酶等)的编码基因转化宿主细胞，培养该细胞，从而生产紫穗槐二烯。在本专利技术的另一方面，提供一种生产青蒿酸的方法，所述的方法包括将所述的突变型紫穗槐二烯合酶的编码基因，法尼基焦磷酸产生酶(MVA/MEP途径中的酶)编码基因，青蒿酸合成酶编码基因，细胞色素P450还原酶编码基因转化入宿主细胞；培养该细胞，从而生产青蒿酸。在另一优选例中，还包括将获得的青蒿酸通过有机半合成生产青蒿素。在另一优选例中，在25_45°C下培养所述的细胞。在另一优选例中，在35-43°C下培养所述的细胞；更佳地，在38-42°C下培养所述的细胞。在另一优选例中，在PH下6. 0-10. 5下培养所述的细胞。在另一优选例中，在PH下8. 5-10下培养所述的宿主细胞；更佳地，在PH下9-10下培养所述的宿主细胞；最佳地为PH9. 8。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、ADS及突变克隆的序列对比结果。从结果中可以看出，399位氨基酸残基T突变成了中性氨基酸残基S、A、N，和带电荷的氨基酸残基R、D0图2、ADS及其突变体的GC-MS图。A-F分别代表野生型和不同突变体GC-MS图；G和H分别代表E图和F图的放大图。I显示了 a-Gur junene (I)和Zingiberene (2)的结构图。其中AMO代表紫穗槐二烯。 图3、温度(上图)、pH(下图)对野生型和突变体ADS(T399S)活力的影响。具体实施例方式本专利技术人经过长期的研究，意外地获得了一种突变型紫穗槐二烯合酶，所述的突变型紫穗槐二烯合酶在保持催化产物不变的情况下，酶活性大大高于野生型。基于此完成了本专利技术。本专利技术的多肽(突变型紫穗槐二烯合酶)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本专利技术的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本专利技术的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本专利技术的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本专利技术还包括突变型紫穗槐二烯合酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本专利技术的突变型紫穗槐二烯合酶相同的生物学功能或活性的多肽。本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变型紫穗槐二烯合酶，其对应于SEQ？ID？NO：2氨基酸序列的第399位由苏氨酸突变为丝氨酸。

【技术特征摘要】
2011.04.02 CN 201110084331.41.一种突变型紫穗槐二烯合酶，其对应于SEQ ID NO :2氨基酸序列的第399位由苏氨酸突变为丝氨酸。2.如权利要求I所述的蛋白，其特征在于，该蛋白是 (a)具有SEQID NO 3所不的氣基酸序列的蛋白；或 (b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO :3第399位上的氨基酸为丝氨酸。3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组 (i)编码权利要求I或2所述的突变型紫穗槐二烯合酶蛋白的多核苷酸；或 (ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQIDNO 3所示氨基酸序列的多肽。5.—种载体，其特征在于，它含有权利要求3或4所述的多核苷酸。6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体，或基因组中整合有权利要求3或4所述的多核苷酸。7.—种生产突变型紫穗槐二烯合酶的方法，其特征在于，包括步骤 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓亚，李建戌，王凌健，洪高洁，胡文利，阮菊新，杨长青，毛颖波，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：