本发明专利技术涉及一种能够鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒，其特征在于：将待检血清用样品稀释液2倍稀释后100ul加入ELISA板中37℃孵育1h，用洗涤液清洗5次，每次2min；然后加入结合单抗每孔100ul，37℃孵育1h，洗涤液清洗5次，每次2min；然后加入羊抗小鼠IgG-HRP结合物37℃作用1h，洗涤液清洗5次，每次2min；然后加入显色底物溶液，将底物A和底物B以1：1混合，100ul加入ELISA孔中，避光显色15min，加入50ul终止液，测其OD490值。该试剂盒方法技术成熟，重复性强，能够有效鉴别经典猪蓝耳病与高致病性猪蓝耳病抗体，一般研究人员即可完成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测猪繁殖 与呼吸综合征病的试剂盒，特别是涉及ー种能够鉴别经典猪蓝耳病与高致病性猪蓝耳病的液相阻断ELISA制备方法，属于ー种新的动物疫病诊断试剂，主要用于临床猪繁殖与呼吸综合征(俗称蓝耳病、PRRS)与高致病性猪蓝耳病(HPRRS)的鉴别诊断及流行病学调查；应用于畜牧兽医学领域。
技术介绍
猪蓝耳病即猪繁通与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratorysyndrome,PRRS),是由猪繁通与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndrome virus, PRRSV)引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的一种传染病。本病于1987年首先爆发于美国，随后迅速传到世界各地，现已成为危害规模化养猪生产的重要疫病之一。而2001年至今，我国毎年都有部分地区不同程度的受到猪“高热病”的危害，经ー系列的研究表明，引起“高热病”的最主要病原为变异的高致病性的PRRSV。仅根据临床症状和病变及流行病学特点很难做出诊断，因此PRRS的确诊需要借助实验室诊断技木，特别是新发生本病的地区和猪场。PRRSV属套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，单股正链有囊膜的RNA病毒，病毒粒子呈球形或卵圆形，直径为45飞5nm，含有2(T35nm的核衣壳，呈二十面体对称，外绕ー脂质双层膜，表面有纤突，较小且不清楚。在我国分尚的毒株属于美洲型，如VR2332株。经测序表明，与经典毒株相比,HPRRS病原的序列变化主要是在Nsp2区缺失了 30个氨基酸，并且致死率明显高于经典毒株。可见，Nsp2中30个氨基酸的缺失与否，成为鉴别高致病性猪蓝耳病与经典猪蓝耳病的重要指标。目前针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测主要采用的技术方法有病毒分离、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、血清中和试验(SVN)、间接荧光抗体试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金技术、反转录、聚合酶链式反应(RT-PCR)、等。上述检测PRRSV抗体的技术多针对结构蛋白，而有关PRRSV非结构蛋白抗体的检测方法还未见报道，且不便于经典猪蓝耳病及高致病性猪蓝耳病的鉴别检測。这些限制了对猪蓝耳病的预防控制，因此研制出ー种特异性强、灵敏度高、简单易行的诊断方法迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒，基于二者差异，利用固相酶联免疫吸附试验(ELISA)原理，以经典PRRSV特有抗原为包被抗原，结合单抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG及其他配套试剂组成。其反应机理为包被抗原和样品中抗经典PRRSV特有抗原的抗体结合导致单抗和抗原的结合量減少，通过酶标抗体形成“包被抗原+结合单抗+酶标抗体”复合物，加入显色剂，通过酶催化反应显色，显色深浅与样品中的检测抗体含量成反比。当抑制率高于设定的临界值时结果判为阳性，表明有抗经典PRRSV抗体存在。判定结果是这样设定的抑制率PI=(0D#i_-0D#p) /0D#i_*100%，PI>20%对应的样品为阳性，小于则为阴性。具有简单、快速、敏感和特异性好等特点；适用于临床鉴别经典猪蓝耳病与高致病性猪蓝耳病。本专利技术的技术方案是这样实现的一种能够鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒，由96孔ELISA板、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、羊抗小鼠IgG-HRP结合物、结合单抗、終止液、底物A 、底物B 、阳性样品、阴性样品、盖板膜组成，其特征在干其中结合单抗为抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸单克隆抗体2B9，其制备方法如下首先制备抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸单克隆抗体，利用杂交瘤技木通过细胞融合、细胞克隆筛选建立的抗经典PRRSV单克隆抗体2B9，所制备单抗只针对经典猪蓝耳病Nsp2蛋白中30个氨基酸，而对高致病性PRRSV抗原无特异性反应，这就决定了试剂盒的特异性； 所述的96孔ELISA板上包被的抗原为由公司合成的经典蓝耳病Nsp2蛋白区特有的30个氨基酸，用包被缓冲液将抗原稀释到O. 7ug/mL, 37°C包被Ih后用含5%脱脂奶粉的PBS封闭Ih，PBS洗涤5次干燥后用铝箔真空密封。本专利技术的积极效果是 I、具有生物安全性，其所使用包被抗原为公司合成的经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有的30个氨基酸，检测单抗2B9为小鼠诱生获得，不含PRRSV，因此不存在散毒的危险。2、特异性强，检测抗体2B9为敏感性和特异性较好的单克隆抗体，因此提高了试剂盒的敏感性和特异性。3、生产成本低，检测单抗可由相应的杂交瘤细胞系通过注射Balb/c小鼠腹腔，诱生腹水，通过辛酸-硫酸铵纯化而大量获得。4、能够良好鉴别经典PRRS与HPRRS，可用于猪场的净化，和流行病学调查。附图说明图I为本专利技术的示意图。具体实施例方式下面结合具体实例对本专利技术做详细说明一种能够鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒，由96孔ELISA板I、样品稀释液2、20倍浓缩洗涤液3、羊抗小鼠IgG-HRP结合物4、结合单抗5、终止液6、底物A 7、底物B 8、阳性样品9、阴性样品10、盖板膜11组成，其特征在于其中结合单抗为抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸单克隆抗体2B9，其制备方法如下首先制备抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸单克隆抗体，利用杂交瘤技术通过细胞融合、细胞克隆筛选建立的抗经典PRRSV单克隆抗体2B9，所制备单抗只针对经典猪蓝耳病Nsp2蛋白中30个氨基酸，而对高致病性PRRSV抗原无特异性反应，这就决定了试剂盒的特异性； 所述的96孔ELISA板上包被的抗原为由公司合成的经典蓝耳病Nsp2蛋白区特有的30个氨基酸，用包被缓冲液将抗原稀释到O. 7ug/mL, 37°C包被Ih后用含5%脱脂奶粉的PBS封闭Ih，PBS洗涤5次干燥后用铝箔真空密封。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例I免疫原的制备 猪蓝耳病Nsp2蛋白区30个氨基酸的缺失与否，是鉴别高致病性猪蓝耳病与经典猪蓝耳病的重要指标。本实验通过公司合成方法合成作为抗原的经典猪蓝耳病Nsp2蛋白区特有的30个氨基酸，并与BSA载体偶联，作为制备单克隆抗体的免疫原。实施例2抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸的单克隆抗体的制备 I、动物免疫选择6 — 8周龄健康Balb/c小鼠，将弗氏完全佐剂乳化的免疫原，每只小鼠腹腔注射50 μ g左右，14d后以弗氏不完全佐剂乳化免疫原蛋白腹腔注射100 μ g，最后一次加强免疫吋，直接腹腔注射100 μ g纯化的免疫原蛋白，融合前3 4d尾静脉注射SOyg纯化的免疫原蛋白。2、细胞融合取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0混合于融合管内，以300g离心lOmin，弃去上清,振荡细胞,使两种细胞尽量混合均匀,然后45s内缓慢滴加预热的PEG溶液，再缓慢加入无血清的1640培养基终止融合，静置后再以1000 r/min离心10 min，弃去上清后加入HAT培养基，使细胞悬浮并混匀，加入适量饲养细胞，于96孔培养板培养，第IOd换液并开始检测筛选。 3、阳性杂交瘤细胞的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种能够鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒，由96孔ELISA板、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、羊抗小鼠IgG-HRP结合物、结合单抗、终止液、底物A、底物B、阳性样品、阴性样品、盖板膜用相应的广ロ瓶加以封装，贴上标签，组装成试剂盒；其中样品稀释液为 NaCl 8. Og ；KH2PO4 O. 2g ；Na2HP04 · 12H20 2. 9g ；KC1 0. 2g 补加ニ馏水至 1000ml ;加入 O. 5ml Tween-20,最后 50ml 分装；20 倍浓缩洗涤液为 NaCl 160. Og ；KH2PO4 4g ；Na2HPO4 · Iffi2O 58g ；KC1 4g 补加ニ馏水致 1000ml ;加入 IOml Tween-20,最后 50ml 分装； 羊抗小鼠IgG-HRP结合物为IOml PBST加入2ul羊抗小鼠IgG-HRP ニ抗，然后加入4%PEG, 25ml 分装； 终止液为2mol/L H2SO4浓硫酸44. 5ml,双蒸水355. 5ml, IOml分装； 底物A为TMB 200mg,无水こ醇100ml,加双蒸水至1000ml, IOml分装； 底物 B 为(O. lml/L 柠檬酸-O. 2ml/L 磷酸氢ニ纳，pH5. 0-5. 4):Na2HP04 1 4. 60g，柠檬酸9.33g, O. 75%过氧化氢尿素6. 4ml,加三蒸水至1000ml,调至pH5. 0-5. 43, IOml分装； 阳性样品为将标准PRRSV...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁壮，刘慧，母连志，黄志强，吕字华，宋德武，杨闽楠，赛度，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。