一种检测花生过敏成分Arah1的双抗体夹心ELISA方法，属于免疫分析技术领域。本发明专利技术首先从新鲜花生仁中获取含Arah1纯度较高的花生蛋白，用其免疫小鼠获得14株单抗，从中选择P/N值最大者的组合为最优组合。利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的，因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量（OD值），即可确定待测抗原含量。本发明专利技术直接、快速、高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的双抗体夹心ELISA法，检测花生过敏成分Arah1。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测花生过敏成分Arahl方法的建立，属于免疫分析
技术介绍
近年来，食物过敏已成为ー个公众性的食品安全问题，而花生是最常见的八大食品过敏原之一。过敏疾病严重危害人们的身体健康，虽然激发过敏反应的最低过敏原的量随着人群的不同而不同，但是微量的过敏原就可以使绝大部分患者产生过敏症状。为了避免接触微量的过敏原，过敏原的检测成为当务之急。现在，虽然有许多过敏原检测方法可供借鉴，但在具体应用上都存在着各自不同的问题。体内实验方法可提供最为直接的证据，但由于安全因素等方面的考虑，只有在不得已的情况下在医院进行，而且费用昂贵、风险大；与此相比体外实验方法具有方便、安全点，但却存在着准确性差的缺点。目前体外微量的检测方法有免疫法、PCR法、组胺释放实验法、过敏原指纹快速检测法等。虽然目前有关过敏原检测的方法很多，但都存在各自不同的问题，如检测速度慢、成本高、需要特定的分析仪器等，这些制约了食品中过敏原检测方法的发展。因此实现准确、安全、经济、快速、高通量、高灵敏的体外检测技术方法具有现实意义。双抗体夹心法是检测抗原的最常用方法，操作步骤如下1)将特异性抗体与固相载体联接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质； 2)加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗体抗原复合物。洗涤除去未结合的抗原物质； 3)加酶标抗体，保温反应。固相抗体抗原复合物上的抗原与酶标抗体結合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时，固相载体上帯有的酶量与标本中受检抗原的量相关；4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种可以直接、快速、高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的双抗体夹心ELISA方法。用于检测花生过敏成分Arahl。本专利技术所说的双抗体夹心ELISA检测花生过敏成分Arahl方法，是鼠抗花生过敏成分Arahl单克隆抗体作为ー抗包被,与其配对成功的鼠抗花生过敏成分Arahl单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记后作为ニ抗，夹心法检测花生过敏成分Arahl。本专利技术方法中所说的鼠抗花生过敏成分Arahl单克隆抗体，其制备方法是杂交瘤的准备，筛选出针对花生过敏成分Arahl的强阳性细胞株14株用于免疫BALB/c小鼠，收集该免疫小鼠的腹水，进行脱脂纯化酶标，将此14株细胞株进行配对筛选，得到配对成功即两株能检测针对花生过敏成分Arahl的细胞株。本专利技术方法的检测分析原理是利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的，因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在本方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。本专利技术的技术方案ー种花生过敏成分Arahl的双抗体夹心ELISA方法， (O酶标板的制备所用的包被原是鼠抗Arahl单克隆抗体，所用包被缓冲液是O. 05Μ、pH9. 6碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含O. I %明胶的上述包被缓冲液； 其中，鼠抗Arahl单克隆抗体是花生蛋白粗提取液免疫BALB/c小鼠制备； (2)酶标ニ抗是辣根过氧化物酶标记与一抗配对成功的鼠抗Arahl单克隆抗体； (3)洗涤液PBST的配方为1000mL蒸馏水中加入氯化钠8 g、磷酸ニ氢钾O. 2g、磷酸氢ニ钠2. 9 g、氯化钾O. 2 g、吐温-20 O. 5mL。(4)标准品稀释液的配方为在含30%体积甲醇的pH 6. 5的PBS中加入质量比为5%的氯化钠； (5)显色液包括A液和B液，A液配方为每100mL水中加入O. 933 g柠檬酸，3. 68 gNa2HPO4 · 12H20,18 μ L 30%Η202 ；Β液配方为60 mg四甲基联苯胺溶于100 mLこニ醇，使用时按A : B=I : I体积比使用； (6)终止液为2mol/L的硫酸； 检测步骤为 1)以鼠抗Arahl单克隆抗体anti-ArahI-NO. 8作为捕获抗体包被酶标板，100 μ L/孔，以O. 05 Μ、ρΗ 9. 6的碳酸钠缓冲液为包被缓冲液，37°C孵育2h ； 2)洗板包被后,将酶标板内容溶液洗掉,拍干,每孔加220μ L洗涤液，放摇床上振动3min，倒掉拍干，再加洗液反复洗板三次； 3)封闭将板拍干后，每孔22(^し封闭液，37で孵育2h，洗板三次拍干，置37°C烘箱15min烘干备用； 4)加受检标本，以NaCl含量为O.9%的O. OlM pH 7. 4的PBS溶液稀释，IOOul/孔，37°C孵育O. 5h，同法洗板拍干； 5)加酶标鼠抗Arahl单克隆抗体HRP-anti-Arahl_NO.5作为检测抗体，以含O. 1%明胶的PBST为抗体稀释液，IOOul/孔，37°C孵育O. 5h，同法洗涤拍干； 6)显色姆孔加入100yL显色液,暗处37 °C反应15 min,取出后姆孔加入100 μ L終止液，用酶标仪測定吸光值A伽。本专利技术的有益效果本专利技术建立了一种可以直接、快速、高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的双抗体夹心ELISA方法，用于检测花生过敏成分Arahl。附图说明图I Arahl双抗体夹心ELISA标准曲线。具体实施方案以下通过实施例进ー步说明本专利技术。一、仪器 TGL 一 40Β台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂KFLOff纯水机，凯佛隆公司 ZD - 9556水平摇床，太仓科教器材厂 Costar96孔8X 12可拆酶标板,上海吉泰生物科技有限公司 MuLtiska Mks 酶标仪，Thermo Labsystems 公司 可调试移液器，Thermo Labsystems公司 涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂 AKTA purifierlO自动快速蛋白纯化系统，superdex 7510/300 GL凝胶过滤柱 GEhealth life sciences 公ロ] 垂直电泳仪Bio-rad公司 倒置生物显微镜德国莱卡公司 ニ、试剂 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG (HRP - IgG)，康成生物工程公司 四甲基联苯胺(TMB)，华美生物工程公司 Arahl标品，Indoor公司 其他试剂均为分析纯试剂 三、步骤 I、花生过敏原的提取与纯化 a、将新鲜花生仁去皮，研磨粉碎。称取10g，按1:10 (W/V)浸入石油醚(60 90)中4°C脱脂，磁力搅拌下过夜，静置0. 5h,8000r离心20min，弃上清，反复脱取三次，沉淀用吹风机冷风吹干。b、随即按1:20 (W/V)浸入0. 05M、pH 7.4 PBS中浸提，磁力搅拌4h，静置0. 5h，8000r离心20min,去残洛,取上清。C、在b所得上清中缓慢加入硫酸铵固体，边加边搅拌，加入的完全溶解后才继续往后加，直至饱和度为30%，4°C静置0. 5h，8000 r/min离心20 min，沉淀用所述PBS复溶。继续往上清液中加硫酸铵同理得到60%、80%本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种捡测花生过敏成分Arahl的双抗体夹心ELISA方法,其特征在于 (O酶标板的制备所用的包被原是鼠抗Arahl单克隆抗体，所用包被缓冲液是O. 05Μ、pH9. 6碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含O. I %明胶的上述包被缓冲液； 其中，鼠抗Arahl单克隆抗体是花生蛋白粗提取液免疫BALB/c小鼠制备； (2)酶标ニ抗是辣根过氧化物酶标记与一抗配对成功的鼠抗Arahl单克隆抗体； (3)洗涤液PBST的配方为1000mL蒸馏水中加入氯化钠8 g、磷酸ニ氢钾O. 2g、磷酸氢ニ钠2. 9 g、氯化钾O. 2 g、吐温-20 O. 5mL ； (4)标准品稀释液的配方为在含30%体积甲醇的pH6. 5的PBS中加入质量比为5%的氯化钠； (5)显色液包括A液和B液，A液配方为每100mL水中加入O. 933 g柠檬酸，3. 68 gNa2HPO4 · 12H20,18 μ L 30%Η202 ；Β液配方为60 mg四甲基联苯胺溶于100 mLこニ醇，使用时按A : B=I : I体积比使用； (6)终止液为2m...
【专利技术属性】
技术研发人员：匡华，彭娟，胥传来，王利兵，尹玉云，宋珊珊，朱建平，王文彬，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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