本发明专利技术公开了木霉菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）木霉菌种的种子培养；2）将步骤1）得到的木霉菌种子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液；3）将步骤2）得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，得到木霉液态发酵液；4）将步骤3）得到的木霉液态发酵液置于去淀粉马铃薯渣固体培养基中进行固态培养。本发明专利技术的有益效果为：1、本发明专利技术提供的技术方案采用易得且廉价的去淀粉马铃薯残渣生产木霉菌剂，解决了成本高、配方复杂等问题，同时解决了马铃薯渣造成的环境污染、以及不能充分回收利用的问题；2、本发明专利技术提供的技术方案产生木霉分生孢子的数量可以高达3.2×1012cfu/g底物，产孢量是现有技术的100倍，提高了产出率、更大程度的节约了成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物菌剂的制备方法，具体涉及。
技术介绍
目前生产上常用的木霉菌剂多为分生孢子制剂，国外已有商品化的木霉制剂问世，如美国的Topshield (哈茨木霉T-22)和以色列的Trichodex (哈茨木霉T39)。国内也有少量的报道，如北京中美陆公司生产的木霉厚垣孢子制剂迈可键III。木霉菌剂的制备要经过ー级种子培养、ニ级液体扩大培养、三级固体培养。自从木霉菌的生防效果得到广泛的认同以来，许多研究者就对其培养基质进行了大量的摸索。 (I)液体扩大培养 Jackson和whips等发现在丙氨酸ー葡萄糖培养产生的菌丝干重比糖蜜一酵母粉培养生物量要高。Lewis和PaPavizas等研究发现糖蜜一玉米培养基在支持木霉生长和产孢方面优于蔗糖一硝酸盐培养基和葡萄糖一酒石酸培养基。目前国内在木霉液体培养以获得高的生物量方面文献比较少，仅有陈卫辉等木霉的浅层液体培养条件进行过初歩研究，他们用虫草头孢废液添加几种中草药(青篙、黄芩、贯众和板蓝根)作为培养基，接种哈茨木霉的分生孢子进行培养，可获得I. 67xl08个孢子/皿，应用虫草头孢废液组合培养液培养哈茨产孢量比H)培养液、查氏培养液和理查德培养液都高。⑵固体发酵 Lewis和Papaviazs等研究了木霉在各种固体培养基上产生孢子量的情况。以石英砂加松锯末、可可壳粉、咖啡壳粉、花生壳粉、玉米芯或麦麸皮等为原料，研究表明麦麸皮的效果最好，玉米粉和花生壳粉在刺激木霉产生孢子方面与麸皮的效果是相同的。朱辉等用城市垃圾加30%麦麸皮，接种量30%，8-10天得到孢子量IO9个/g。王永东等用麸皮、玉米粉3:1配比，蔗糖I. 5%，蛋白胨I. 5%，硝酸I. 0%，磷酸ニ氢钾O. 05%,缓冲盐NaH2PO4-Na2HPO4 (O. 50%-0. 50%)接种量 90%，温度 22_25°C，9d 产孢量达 I. OxlO10 个 /g。田连生(2006)等利用玉米秸杆制备木霉生物杀菌剂。张双玺(2008)等利用植物农药残渣生产绿色木霉(Trichoderma viride)菌制剂。武宽等(2007)利用甘鹿洛,麦麸,米糠组成的固体发酵培养基培养木霉，在相対湿度60-80%，温度25-28V条件下，培养4_5天后，在12°C以下低温培养2-3天。固体发酵产物在40-50°C温度下干燥12-24小时，加入由硅藻土，麦麸，硫磺组成的促进剂。混合均匀，粉碎后过40目筛，即得木霉粉剂和粉粒剂。文献报道的作为生防剂的木霉菌生产方法所采用的培养基以粮食为主。另外有些文献报道的作为生防剂的木霉菌生产方法所采用的培养基以粮食为主。如中国专利(公开号CN1554242A)中公开了ー种木霉菌的生产方法，其培养基主要是颗粒直径在1-5毫米之间的小米、稻米、玉米、大麦、小麦或高梁。中国专利(公开号CN1422946A)中公开了ー种木霉菌的生产方法，其生产原料主要是大麦、鼓皮、筱麦等。杨合同利用玉米粉、麦麸等成分，采用液一固两相发酵技术生产木霉分生孢子取得成功。固体发酵是生产木霉制剂中最为关键的技术之一。直接决定制剂的防病效果和制剂生产成本。而固体发酵中最重要的是培养基质的选择，选择适宜的培养基质可以简化操作、降低成本、保证制剂性能，同时可以利用残渣废料以减少环境污染。张双玺，张兴在《利用植物农药残渣生产緑色木霉孢子的研究》中描述了以下制备方法 1、加工原料植物农药沙地柏残渣； 2、液体发酵利用PDA培养基平板培养绿色木霉菌，待菌丝长满培养皿并变为绿色后，每皿加入IOml灭菌水，用接种环搅拌使孢子悬浮在水中，用移液管吸出悬浮液移入灭菌三角瓶中，孢子数量用血球计数板计数，然后用灭菌水将孢子浓度调整为IXlO8Ail ； 3、固体发酵沙地柏残渣在75°C条件下用酒精提取4h，滤渣自然风干，麸皮在120°C烘干粉碎，鸡粪在150°C烘干粉碎，沙地柏麦麸鸡粪硫酸铵比例为12 4 3 :1，准确称取5g，121°C灭菌30 min，摇匀，接IX IO8AiL绿色木霉孢子悬浮液O. 5ml，28°C培养箱培养，绿 色木霉菌孢子培养的最佳时间为8-12d，其产孢量达到7. 4XlOVgo上述技术及培养基质有以下缺点 I、材料稀少 该技术所用原料为植物农药沙地柏残渣，沙地柏产于我国新疆天山至阿尔泰山、宁夏、内蒙古、青海东北部、甘肃祁连山北坡、陕西榆林，海拔1100-2800Π1地带多石山地及沙丘上。北京、西安等地有引种。沙地柏常用于改善干旱、半干旱地区的环境和防止沙漠化进程，用于生物农药的提取报道较少。原材料难以获取，不适合大規模生产使用。2、配方复杂 该技术所用配方较为复杂，所用材料为沙地柏、麦麸、鸡粪、硫酸铵四种，操作繁琐。3、产孢量低 培养8-12d，其产孢量才达到7.4X109/g。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了培养基原材料容易获取、配方简单，产孢量高的。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为，包括以下步骤 1)木霉菌种的种子培养所述木霉菌种为长枝木霉r/ricAoofe/maIongibrachiatumRifai);将木霉种子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，培养温度为25-30°C，光照条件为光照8-16小时、黑暗8-16小时交替，培养时间为4天； 2)将步骤I)得到的木霉菌种子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为lX103cfu/ml-lX108cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节PH为4-7 ； 3)将步骤2)得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，发酵培养基质为去淀粉马铃薯渣培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液去淀粉马铃薯渣培养液为1:55-1:70培养条件为25°C -28°C，摇床培养140r/min-160r/min，连续培养5_7天，得到木霉液态发酵液； 4)将步骤3)得到的木霉液态发酵液置于去淀粉马铃薯渣固体培养基中进行固态培养，所述去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蓬松剂，按质量比去淀粉马铃薯渣蓬松剂为5:1，按质量比固体培养基发酵液为搅拌均匀，培养条件为25-30°C，静态培养8-10天，得到木霉菌剂，其中，产孢量为每克培养底物产出3. 2X IO12Cfu单位木霉孢子。上述的，所述步骤I)中，培养温度为27°C，光照条件为光照12小时、黑暗12小时交替。上述的，所述步骤2)中，稀释浓度为lX106cfu/ml，调节PH为5。上述的，所述步骤3)中，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液去淀粉马铃薯渣培养液为1:60 ;培养条件为25°C，摇床速度为150r/min，连续培养时间为6天。上述的，所述步骤4)中，蓬松剂为珍珠岩、蛭石和/或麦麸的 混合物。上述的，所述步骤4)中的去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蛭石和/或麦麸；所述去淀粉马铃薯渣的制备方法为将淀粉生产后的马铃薯残渣烘干后粉碎至20目得到的。本专利技术的有益效果为 1、本专利技术提供的技术方案采用易得且廉价的去淀粉马铃薯残渣生产木霉菌剂，解决了成本高、配方复杂等问题，同时解决了马铃薯渣造成的环境污染、以及不能充分回收利用的问题； 2、本专利技术提供的技术方案产生木霉分生孢子的数量可以高达3.2X1012cfu/g底本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.木霉菌剂的制备方法，其特征在干包括以下步骤 1)木霉菌种的种子培养所述木霉菌种为长枝木霉；将木霉种子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，培养温度为25-30°C，光照条件为光照8-16小时、黑暗8-16小时交替，培养时间为4天； 2)将步骤I)得到的木霉菌种子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为lX103cfu/ml-lX108cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节PH为4-7 ； 3)将步骤2)得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，发酵培养基质为去淀粉马铃薯渣培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液去淀粉马铃薯渣培养液为1:55-1:70培养条件为25°C -28°C，摇床培养140r/min-160r/min，连续培养5_7天，得到木霉液态发酵液； 4)将步骤3)得到的木霉液态发酵液置于去淀粉马铃薯渣固体培养基中进行固态培养，所述去淀粉马铃薯渣固体培养基包括有去淀粉马铃薯渣和蓬松剂，按质量比去淀粉马铃薯渣蓬松剂为5 :1，按质量比固体培养基发酵液为1:1-1:2，搅拌均匀，培养...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐秉良，古丽君，郭景致，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：
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