一种肽聚糖单克隆抗体的制备及其产品。本发明专利技术以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)为出发菌株制备的肽聚糖作为免疫原，免疫小鼠，检测小鼠血清效价达到后进行细胞融合，经亚克隆筛选获得4株单克隆细胞株，命名为5A6、3F8、4E4和3G4，亚类鉴定其亚型5A6是lgM，3F8、4E4和3G4都为IgG1。4株抗体纯化后经间接酶联免疫方法筛选出3F8有很强的广谱性，与干扰物进行交叉反应确定其特异性良好。用3F8作为竞争抗体，用酶标二抗(羊抗鼠)作为显色抗体，用间接竞争酶联免疫原理，制备革兰氏阳性菌肽聚糖检测试剂盒，灵敏度达到1μg/ml。
【技术实现步骤摘要】
一种肽聚糖单克隆抗体的制备及其产品所属领域生物医药范畴，确切说是ー种肽聚糖的单克隆抗体制备的方法及相关应用于临床诊断革兰氏阳性菌的产品。
技术介绍
经初步检索，未查到以金黄色葡萄菌提取的肽聚糖等天然抗原来免疫小鼠，制备单克隆抗体专利，并且临床没有针对革兰氏阳性菌感染快速检测手段。
技术实现思路
填补国内革兰氏阳性菌肽聚糖单克隆抗体的空白，为临床诊断革兰氏阳性菌感染提供參考，本专利技术的肽聚糖单克隆抗体，不仅能够检出金黄色葡萄球菌的肽聚糖，而且对革兰氏阳性菌肽聚糖具有广谱性和对革兰氏阴性菌肽聚糖不发生特异性反应的特征。本专利技术的技术方案是以金黄色葡萄球菌出发菌株，采用青霉素钠诱导法和葡聚糖G-100(S印hadex G-100)凝胶柱分离提取金黄色葡萄球菌肽聚糖。以此为免疫原，免疫Balb/c雌性小鼠，通过有限稀释法获得亚克隆细胞株，通过亚类鉴定获得3株IgGl和I株IgM单克隆细胞株，将获得的4株单克隆细胞株培养后，注入小鼠腹腔内(提前一周注射降植烷)。10-15天，取小鼠腹水，通过硫酸铵沉淀提取方法结合亲和层析纯化技术来纯化IgG抗体，通过聚こニ醇沉淀提取和凝胶层析纯化IgM抗体。将4株抗体通过间接酶联免疫方法筛选出具有广谱性的I株单克隆抗体，通过间接竞争法来測定抗体的特异性良好，以这株单克隆抗体建立用于检测革兰氏阳性菌肽聚糖间接竞争酶联免疫试剂盒。本专利技术的有益效果是，确定了血清及其它体液的预处理方法，得到的单克隆抗体可以为临床快速诊断的革兰氏阳性菌感染提供參考和数据支持。附图说明图I是肽聚糖提取流程图；图2是纯化的肽聚糖抗原的S印hadex G-100凝胶柱的分离图；图3是4株单克隆抗体纯化后非变性电泳图；图4是4株单克隆抗体对沙克乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌来源的肽聚糖交叉反应率图；图5是3F8对金黄色葡萄球菌肽聚糖、大肠杆菌脂多糖、酵母菌1，3- β -D-葡聚糖和大肠杆菌肽聚糖的交叉反应率图；图中A是金黄色葡萄球菌肽聚糖，B是大肠杆菌脂多糖，C是酵母菌I，3-β -D-葡聚糖，D是大肠杆囷妝聚糖。具体实施例方式先參照说明书附图将本专利技术内叙述如下—、金黄色葡糖球菌菌株的来源金黄色葡萄球菌购买自中国科学院微生物研究所微生物菌种保藏管理中心。ニ、金黄色葡萄球菌的培养I.金黄色葡萄球菌培养基配方(1)7. 5% Nacl 肉汤培养基胰蛋白胨IOg牛肉膏3gNaCl75g蒸馏水800ml用5NNa0H调pH值至7. 6，定容至1000ml，115°C灭菌20mi0高压蒸气灭菌，4°C保存。(2)基本培养基葡萄糖5.647g甘氨酸75.07mgDL-谷氨酸147_12mgDL-丙氨酸66.82mgL-赖氣酸29.24mg尿嘧啶19.06mg甘油11.51mg氯化镁95.21 mg氯化猛12.59mg硫胺I.OI mg烟酸I.OI mg80mmol/L PBS0.8L用5NNa0H调pH值至6. 8，过滤灭菌，4°C保存。2.金黄色葡萄球菌培养条件37°C，200rpm，培养 18 个小时。三、金黄色葡萄球菌抗原的提纯肽聚糖抗原的纯化主要包括以下几个步骤，见说明书附图I :I.增菌培养取金葡菌ATCC 25923单个菌落接种于1000ml 7. 5% Nacl肉汤培养基中，37°C、200转/min振荡培养18h，此时细菌为对数生长期，菌液浓度约2 5X IO8CFU/ml ；2.高速冷冻离心机1500转/min、30 37°C、15min离心，收集细菌沉淀，PBS洗3次；3.尽快将沉淀转到37°C基本培养基(IL)中，放置于37°C恒温电培养箱中5min，此时混合液0D660约I. 4 I. 6 ;4.加入 37°C青霉素溶液(10mg/ml)7.5ml，37°C、200 转/min 振荡 Ih;5. 95°C、30min 进行灭菌； 6. 1500 转/min、4°C、20min 离心，收集上清；上清再 6500 转/min、4°C、20min 离心，收集上清；7.上清超滤通过O. 22um滤膜；8.旋转蒸发仪浓缩至IOOml左右，4°C冰箱冷存备用；9.葡聚糖G-100凝胶柱的制备称取葡聚糖G_10015g，加到300ml蒸馏水中，100°C水浴3h。然后，将冷却的混悬液缓慢加入柱内，根据AKT-HPLC分析仪压カ要求进行装柱。用三蒸水平衡凝胶柱，调流速O. 5 lml/min ；10.葡聚糖G-100凝胶 柱层析分离取30ml备用的浓缩样品，O. 22 μ m滤膜过滤，取20ml滤过液上样,流速为3ml/min,紫外检测波长为215nm,用三蒸水进行洗脱,收集第一个峰(见说明书附图2)；11.将所得峰旋转浓縮，冻干后4°C冰箱保存。四、单克隆抗体的制备与纯化I.使用动物为Bablc小鼠6周大小，雌性，驯化一周后开始免疫。2.免疫浓度为125 μ g蛋白/只老鼠，注射体积为1ml，混合等量的弗氏佐剂/不完全弗氏佐剂/生理盐水，并充分乳化。3.初次免疫混合等量的弗氏佐剂，二次和三次免疫混合等量的不完全弗氏佐剂，末次免疫混合等量的生理盐水。4.阳性克隆筛选采用直接酶联免疫反应法检测，酶标抗体选用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠的IgG。末次免疫后，引颈杀死小鼠，取其脾脏细胞；另取阴性对照健康小鼠，同样取脾脏细胞，制备成5.饲养细胞，杂交瘤细胞选用sp2/0骨髄瘤细胞。6.在无菌条件下，将脾脏细胞骨髄瘤细胞=5 I比例混合于不完全培养基中，使用PEG1450作为融合剂，按照一般细胞融合细胞制备方法进行细胞融合。7.融合后，转移至预先加有完全培养基和饲养细胞的96孔板中。8.采用HAT培养基法初步筛选融合细胞。接着使用直接酶联免疫反应法来筛选阳性融合细胞，分别使用抗原、对照抗原(酵母来源的乳糖、大肠杆菌来源的脂多糖)进行排除筛选。9.单克隆细胞的制备采用有限稀释法，毎次稀释后，进行阳性细胞的筛选。10.将经过三次稀释后的单克隆细胞，筛选出4株单克隆细胞株并命名为5A6、3F8、4E4和3G4，进行亚型鉴定显示5A6是IgM型，3F8、4E4和3G4是IgGl型。11.接着按照常规方法进行腹水制备。12.收集腹水,按照硫酸铵沉淀和Protein G亲和层析的方案来纯化IgGl抗体,按照聚こニ醇沉淀提取和Surperdex 200凝胶层析的方案纯化IgM抗体。13.纯化后的抗体经非变性电泳进行鉴定为唯一条带(见说明书附图3)。五、单克隆抗体的性能I.单克隆抗体广谱性的筛选以间接酶联免疫方法測定所获得的单克隆抗体与各种革兰氏阳性菌的肽聚糖的交叉反应性。单克隆抗体定量后梯度稀释，计算所得抗体与各种来源的肽聚糖的交叉反应率本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种肽聚糖单克隆抗体制备及其产品，首先采用青霉素钠诱导法和葡聚糖G-IOO (Sephadex G-100)凝胶柱分离提取金黄色葡萄球菌的肽聚糖，接着免疫小鼠，制备单克隆抗体3F8，其特征为=IgG1型免疫球蛋白，广谱性强，特异性强。使用3F8抗体，配合酶标ニ抗(羊抗鼠)，可以制备成试剂盒，其特征为用来检测血清中革兰氏阳性菌的肽聚糖，作为临床诊断的參考之一。2.根据权利要求I所述的金黄色葡萄球菌来源为中国科学院微生物研究所微生物菌种保藏管理中心。3.根据权利要求I所述的肽聚糖纯化的步骤为采用青霉素钠诱导法和葡聚糖G-100 (Sephadex G-100)凝胶柱分离提取金黄色葡萄球菌肽聚糖。4.根据权利要求3所述的肽聚糖纯化的青霉素诱导法为用青霉素诱导金黄色葡萄球菌向环境中分泌出肽聚糖，青霉素溶液浓度为10mg/ml，诱导条件为37°C、200转/min振荡Ih05.根据权利要求3所述的肽聚糖的葡聚糖G-100(Sephadex G-100)凝胶柱分离提取为分子筛层祈，采用...
【专利技术属性】
技术研发人员：苑庆华，何永胜，
申请(专利权)人：天津市一瑞生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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