一种筛选肿瘤化疗增敏剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选肿瘤化疗增敏剂的方法，包括以下步骤：a)让候选化合物和细胞接触；b)加入线状病毒(Filoviridae)感染细胞；c)测量线状病毒对细胞的感染。本发明专利技术利用候选化合物直接抑制多药抗药性(multidrug?resistance，MDR)相关的运输通道蛋白的活性时，也同时会抑制病毒的入侵的特点，选取化合物对病毒入侵的抑制为指标来筛选肿瘤化疗药物增敏剂，这种基于病毒感染的药物筛选方法，简单(以病毒感染为参数)，快速(10小时后，可以得到结果)，高通量(每天可以完成1-5万化合物的筛选)。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，特别涉及。
技术介绍
肿瘤化疗失败，90%以上的原因是肿瘤细胞对肿瘤药物产生了抗性而导致的，也就是肿瘤细胞的多药抗药性((multidrug resistance, MDR))。决定肿瘤抗药性的因素有多种可能，其中最重要的是肿瘤细胞会把药物快速地运出细胞，使药物在肿瘤细胞质中的滞留时间缩短，大大降低药物的作用效果。承担药物运输的主要元件就是各种运输通道蛋白(transporter),包括向细胞内(uptake)和向细胞外(efflux)运输的两类运输通道蛋白。前者把抗肿瘤药物运进细胞,后者把药物运出细胞。研究发现，肿瘤干细胞通过大量表达将药物运出的运输蛋白(ABC运输蛋白,ATP-binding cassette运输蛋白)的方式,来降低细胞内药物的有效浓度,从而产生抗药性。因此ABC运输蛋白是新的药物靶点。这类蛋白有48个成员，其中对MDRl、MPR1和BCRP的研究显示，这三个蛋白的过量表达和癌细胞的抗药性紧密相关，是肿瘤抗药现象最常见的机制。这些发现，为癌症治疗药物的研发提供了一个新的方向抑制MDRUMPR1和BCRP等通道蛋白的活力，使化疗药物可以滞留在肿瘤细胞内，提高肿瘤细胞对药物的敏感性、逆转肿瘤细胞的抗药性。总体说来，提高化疗药物的疗效，降低其毒副反应是根治肿瘤的重要措施。因此，低毒高效的化疗增敏剂具有广泛的应用前景，加快化疗增敏剂的开发和研究将会为肿瘤治愈带来新的希望。目前筛选针对运输蛋白的化疗增敏剂的方法，主要采用的是实验筛选的方案。MDRU MPRl和BCRP是最重要化疗增敏剂类药物靶点，它们都是多次跨膜结构，功能和三维结构都很复杂。基于结构的虚拟药物筛选不适用于这类蛋白，所以主要采用的是实验筛选的方案。目前的实验筛选都采用了一个基本的原则当候选化合物抑制了MDRl等蛋白的活力，那么抗肿瘤药物可以在更低的浓度或者更短的时间里杀死肿瘤细胞。所以采取的是直接观察肿瘤细胞死亡过程，来评价候选化合物的效果。基本程序是先分离、培养MDRl等蛋白过量表达的肿瘤细胞，加入抗肿瘤药物，同时加入候选化合物，如果MDRl等目标蛋白对候选化合物敏感、活力降低或丧失，那么可以观察到肿瘤细胞的死亡；作为对照，不加入化合物或者加入对MDRl等目标蛋白无作用的化合物，同样浓度下抗肿瘤药物不会杀死肿瘤细胞。类似的方案已经沿用多年，但是这些方法都存在缺陷1)需要培养肿瘤细胞来针对性筛选；2)观察肿瘤细胞死亡耗费时间和精力；3)无法选取指标或参数来实现大规模筛选。这几个缺陷，导致针对MDRl等靶点蛋白的药物研发进展缓慢，至今还没有一个相关药物由FDA批准进入临床应用阶段。要克服这些缺陷，需要新的方案来实现大通量筛选，从海量的化合物库中找到好的候选化合物。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题就是针对传统的筛选化疗增敏剂的方法存在耗时、费精力、难以大规模筛选的缺陷，提供一种更简单、明了、易于实现大通量筛选的新的筛选化疗增敏剂的方法。本专利技术提供，包括以下步骤a)让候选化合物和细胞接触；b)加入线状病毒(Filoviridae)感染细胞；c)测量线状病毒对细胞的感染。本专利技术中，步骤a)所述的细胞优选表达来源于灵长类MDRl的细胞。本专利技术中，步骤a)所述的候选化合物较佳的是现有的组合化合物库或者天然产物库，如从中草药中提取和分离天然化合物库。本专利技术中，步骤b)所述的线状病毒(Filoviridae)，优选埃博拉病毒(ZaireEbolavirus请给出拉丁名)和/或马尔堡病毒(Marburgvirus)。本专利技术中，步骤b)所述的病毒优选假病毒。较佳的，假病毒的衣壳蛋白(ENV)来自线状病毒属(Filoviridae)，基因组中包含有报告基因。所述的报告基因可以是本领域常规的报告基因，优选荧光素酶或者荧光蛋白的编码基因。本专利技术中，步骤c)所述的测量线状病毒对细胞的感染的方法是本领域的常规方法，较佳的，通过测量重组假病毒表达的荧光素酶的活力或者荧光蛋白的荧光强度来表征病毒对细胞的感染。本专利技术所述的方法优选所有加样过程由机械臂完成的高通量的方法，可以实现高通量、大规模的筛选。本专利技术的方法筛选到的化合物抑制线状病毒的感染细胞，同时这些化合物也是肿瘤化疗增敏剂/或ABC运输蛋白抑制剂。本专利技术中，所述的“肿瘤化疗增敏剂”是指促进化疗药物滞留在肿瘤细胞内，提高肿瘤细胞对药物的敏感性，逆转肿瘤细胞的抗药性的药物。本专利技术所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。附图说明以下结合附图说明本专利技术的特征和有益效果。图I是MDRl的表达水平降低对线状病毒感染力的影响。图2是肿瘤细胞中MDRl的表达水平和线状病毒感染力之间的关系。其中，2A是MCF7 细胞；2B 是 MDA-MB-231 细胞。图3是MDRl的抑制剂对线状病毒感染力的影响。其中，3A是3. 5 μ Mcompound C对线状病毒感染力的影响；38是7511|1 Verapamil对线状病毒感染力的影响；3(是2(^皿cyclosporinA对线状病毒感染力的影响。具体实施方式 本专利技术人经过仔细研究和反复试验，惊喜的发现化合物直接抑制MDR(多药抗药性，multidrug resistance)相关蛋白的活性时，也同时抑制线状病毒的入侵。因此,本专利技术人利用这种相关性，选取化合物对病毒入侵的抑制作用为指标来筛选肿瘤化疗增敏剂，经过反复试验论证，终于得到了一种简单、能够实现高通量的筛选肿瘤化疗药物增敏剂的方法，从而完成了本专利技术。一、线状病毒入侵过程和MDR具有相关性 本专利技术人发现，在线状病毒侵入的多种细胞中，包括来自狗、猪、啮齿和灵长类等的细胞，当MDRl蛋白的活性受到抑制或者在细胞中的数量减少，线状病毒入侵该细胞的能力也会相应地下降。一个例子是在人源细胞293T的感染实验中，当用shRNA来降低MDRl的表达后，埃博拉病毒和马尔堡病毒对细胞的入侵能力都明显下降，见图I。另外一个突出的例子是采用MDRl表达或活性缺陷的细胞系，MCF7和MDA-MB-231。该两株细胞有个共同点是MDRl表达很低的乳腺癌细胞系，对肿瘤化疗药物阿霉素敏感。实验证实，埃博拉病毒和马尔堡病毒不能很好的入侵这两株细胞；然而在外源引入MDRl的表达后，两株细胞对阿霉素敏感度下降，与此同时，埃博拉病毒和马尔堡病毒对细胞的入侵能力也大幅度上升(见图2A、2B，和表I)。在这两个例子中，作为对照，MDRl蛋白活性的变化并不会明显影响到其他病毒，如VSV和LCMV对细胞的入侵能力(见图1、2)。因此，线状病毒入侵细胞过程和MDRl的活性间存在相关性。二、线状病毒的感染能力和MDRl的表达及活力密切相关本专利技术人选取了多个经证实的MDRl抑制剂，包括compound C、VerapamiI和cyclosporinA均成功抑制了线状病毒对细胞的感染，但是阴性对照病毒VSV，LCMV不受影响(见图3)。因此，线状病毒的感染能力和MDRl的表达及活力密切相关，表明线状病毒对细胞侵染力的变化可以作为筛选MDRl等蛋白抑制剂的表观指标。三、利用线状病毒对细胞侵染力的变化来筛选肿瘤化疗增敏剂的方法本专利技术以线状病毒对细胞侵染力的变化作为表观指标，筛选MDRl等蛋白抑制剂，包括以下步骤a)培养细胞；b)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选肿瘤化疗增敏剂的方法，其特征在于，包括以下步骤 a)让候选化合物和细胞接触； b)加入线状病毒(Filoviridae)感染细胞； c)测量线状病毒对细胞的感染。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤a)所述的细胞是表达来源于灵长类MDRl的细胞。3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，步骤a)所述的候选化合物是现有的组合化合物库或者天然产物库。4.如权利要求I 3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤b)所述的线状病毒是埃 博拉病毒(Ebolavirus)和/或马尔堡...

【专利技术属性】
技术研发人员：李琦，
申请(专利权)人：李琦，
类型：发明
国别省市：