一种检测化学物致癌性和促癌性的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测化学物致癌性和促癌性的方法。使用转染HPV16?E6E7基因的Balb/c?3T3细胞，通过细胞转化实验检测化学物的致癌性和促癌性。与传统的II阶段Balb/c?3T3细胞转化实验相比，该方法可使细胞形成更多的转化灶，明显提高实验的敏感性；并可以有效缩短实验时间，节省人力财力投入，降低检测成本；避免使用额外的致癌剂和促癌剂，有助于保护环境和实验人员安全，该方法可用于评价化学物的致癌性和促癌性，还可以从药品、化学品、环境污染物和工业废弃物等中筛查未知致癌物和促癌物，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测方法，具体涉及ー种检测化学物致癌性和促癌性的方法。
技术介绍
体外细胞转化实验是指细胞在致癌物诱导下产生特定的表型改变，主要体现在生长和行为控制能力的变化，如细胞形态的改变、克隆形成模式的紊乱、非锚定依赖性生长能カ的获得、自分泌生长因子的产生以及对适合宿主的致瘤性等。由于Balb/c 3T3细胞转化实验与动物致瘤实验结果具有较高的一致性，因此被国际癌症研究所(IARC)认定为一种有效的评价致癌物的方法，实验终点是细胞形态学的 转变和转化灶的形成。该方法的优点是操作简单、实验周期较短、结果稳定可靠、重复性好、排除体内复杂的神经内分泌等因素的干扰、便于在体外直接观察和记录细胞癌变过程，是从细胞生物学水平上研究肿瘤发生与发展的基本技木。Balb/c 3T3细胞系是Aaronson等在1968年建立的,来源于14-17天的Balb/c小鼠胚胎。最早的实验方案是由Kakunaga于1973年提出的,之后经历了很多改进，如pH、血清、细胞培养方法、接种密度、化学物处理方式、细胞培养时间、细胞对致癌物的应答等。尽管一些优化方案可以增加转化频率，但仍需进ー步改进以提高实验敏感性，并将血清等对细胞转化实验结果的影响降至最小。目前国际普遍采用的检测化学物致癌性和促癌性的实验方法是II阶段Balb/c 3T3细胞转化实验，其步骤包括取对数生长期Balb/c 3T3细胞，以IX IO4个/瓶接种至培养瓶中，用含10% (V/V)胎牛血清的DMEM培养基培养，24h后加入化学物1，第4天换含2% (V/V)胎牛血清的DMEM/F12(1 I)培养，分别于第7、10、14天加入化学物2,培养4周，姆周换液2次,细胞经甲醇固定、Giemsa染色,计数转化灶。在检测化学物致癌性时，加入的化学物2为12-0-十四烷酰佛波醇-13-こ酸酯(TPA);在检测化学物促癌性是，加入的化学物I为3-甲基胆蒽(MCA)。该方法存在以下问题(I)该实验中细胞在化学物的诱导下形成的转化灶数不多，实验的敏感性不够闻;(2)实验周期较长，人力财カ投入较大，检测成本较高；(3)需要额外使用阳性致癌物MCA和阳性促癌物TPA。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了ー种敏感的检测化学物致癌性和促癌性的体外细胞转化实验方法，解决了细胞形成的转化灶数不多，实验的敏感性不高，实验周期较长以及需要额外使用阳性致癌物和阳性促癌物等问题。为达到此目的，本专利技术采用如下技术方案一种检测化学物致癌性和促癌性的体外细胞转化实验方法，包括以下步骤(I)将转染HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞以I X IO3-I X IO5个/瓶接种于细胞培养瓶，加入含有10% (V/V)胎牛血清、IOOiI g/ml链霉素、100U/ml青霉素与1% (V/V)谷氨酰胺的DMEM培养基，在37°C，5% (V/V) CO2孵箱中培养24h ；(2)将培养24h后的时间点记为第I天的起始点，在第1-21天加入含有化学物的DMEM培养基或DMEM/F12(1 I)培养基，培养3周，细胞会表现出致密多层、丧失接触抑制、排列紊乱的生长特性，形成明显的肉眼可见的转化灶，转化灶边缘的细胞可自由定向生长井向周围单层细胞侵袭生长，根据细胞形成转化灶的个数，来判断化学物是否具有致癌性和促癌性。上述步骤(2)中所述的DMEM培养基或DMEM/F12(1 I)培养基中含有1_10% (V/V)胎牛血清。进一歩，DMEM/F12(1 I)培养基中还含有 50-500 y g/ml 牛胰岛素、50-500 y g/ml人转铁蛋白、5-50 ii g/mlこ醇胺、5-100ng/ml亚硒酸钠。 本专利技术使用转染HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞，通过细胞转化实验检测化学物的致癌性和促癌性，与传统的II阶段Balb/c 3T3细胞转化实验相比，该方法可使细胞形成更多的转化灶，明显提高实验的敏感性；可以有效缩短实验时间，节省人力财カ投入，降低检测成本；避免使用额外的致癌剂和促癌剂，有助于保护环境和实验人员安全，该方法可用于评价化学物的致癌性和促癌性，还可以从药品、化学品、环境污染物和エ业废弃物等中筛查未知致癌物和促癌物，具有广阔的应用前景。附图说明图I为细胞形成转化灶的形态显微图。转化细胞表现出嗜碱深染、致密多层、丧失接触抑制、排列紊乱、转化灶边缘的细胞自由定向生长、向周围单层细胞侵袭生长等特性。具体实施例方式以下将參照附图，对本专利技术所使用的转染HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞的优选实施例进行详细描述，其构建方法为(I)大肠杆菌DH5 a感受态细胞的制备从37°C培养16_20h的新鮮平板上挑取DH5 a单菌落，接种于5ml不含抗菌素的LB培养基中，37°C剧烈振荡培养12-16h。从上述培养物中按I : 100 (V/V)接种于50mlLB培养基中继续培养至菌液0D600值为0. 4-0. 6时，将细菌转移到无菌、用冰预冷的50ml离心管中，冰浴30min。于4°C下4000rpm离心IOmin,弃上清,将离心管倒置Imin,使残留培养液流尽，以IOml用冰预冷的lOOmmol/L CaCl2溶液重悬细菌沉淀，冰浴30min。于4°C下4000rpm离心IOmin,弃上清，每50ml初始培养物用2ml预冷的含15% (V/V)甘油的IOOmmoI/L CaCl2溶液重悬细菌沉淀，分装成IOOiU每管，_80°C保存备用。(2)质粒的转化自冰箱中取出感态受大肠杆菌，插入湿冰中溶解20分钟；加入I ii I含HPV16全基因组的质粒，轻轻旋转混匀，冰浴30分钟；于42°C水浴中热休克大肠杆菌90秒，迅速移入湿冰中，静置2分钟；加入SOOiU已37°C预热的无抗生素LB培养液，置于37°C恒温箱摇床150-160rpm温育Ih ;取50 已转化的感受态细胞涂于含100 u g/ml氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，将平板置于室温至待干燥后，倒置于37°C的培养箱中220rpm过夜培养12-16小时，检查各培养皿中是否出现菌落。(3)质粒的小量制备以I : 1000 (V/V)的比例在LB培养液中加入氨苄青霉素溶液，挑选琼脂平板上的单菌落接种到5ml培养基中，37°C摇床220rpm培养过夜，培养时间不能超过16h ;将培养物分装在两个I. 5ml离心管中，13000rpm离心lmin，弃上清，将管ロ倒置在纸巾上，管壁上不应有残留上清；加入4°C预冷的250 ill Pl溶液(含50mmol/LGlucose、25mmol/LTris-HCl (pH 8. 0) U Ommo I/L EDTA (pH8. 0)，使用前需加入RNaseA)，剧烈振荡，充分悬浮细菌沉淀;加入250iU新鲜配制的P2溶液(含0. 2mol/L NaOH, I % (V/V) SDS)，温和混匀，冰浴3min,至液体清亮；加入4°C预冷的350 ii I N3溶液(含5mmol/LKAc 60ml >11. 5% (V/V)冰こ酸、28. 5% (V/V) ddH20)，温和混匀，冰浴IOmin, 13000rpm离心IOmin ;小心吸取上清，将上清转移至另ー离心管中，加入本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测化学物致癌性和促癌性的方法，包括以下步骤 (1)将转染HPV16E6E7基因的Balb/c3T3细胞以I X IO3-I X IO5个/瓶接种于细胞培养瓶，加入含有10% (V/V)胎牛血清、IOOii g/ml链霉素、100U/ml青霉素与1% (V/V)谷氨酰胺的DMEM培养基，在37°C，5 % (V/V) CO2孵箱中培养24h ； (2)将培养24h后的时间点记为第I天的起始点，在第1-21天加入含有化学物的DMEM培养基或DMEM/F12(1 I)培养基，培养3周，细胞会表现出致密多层、丧失接触抑...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟儒刚，武双，曾毅，李劲涛，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：