HMGB蛋白及抗体在制备近江牡蛎抗感染免疫制剂中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，旨在提供HMGB蛋白及抗体在制备近江牡蛎抗感染免疫制剂中的应用。该蛋白质的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2?所示；该基因的编码框核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述蛋白质在制备近江牡蛎抗感染免疫制剂中的应用，是将所述蛋白质免疫新西兰大白兔进而获得多克隆抗血清。本发明专利技术获得了近江牡蛎HMGB基因编码框全序列，并通过构建原核表达载体，表达并纯化了可溶性的HMGB蛋白质产品，并制备了其多克隆兔抗血清。其多克隆兔抗血清具有抑制近江牡蛎病原RLO和革兰氏阴性细菌LPS引起的炎症反应及细胞坏死和细胞凋亡的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及HMGB基因、蛋白及在制备牡蛎抗感染免疫制剂中的作用。
技术介绍
高迁移率族蛋白B (high mobility group box,简称HMGB)是高迁移率族蛋白家族的成员，是一族广泛存在于真核生物细胞体内，富含电荷的染色体非组蛋白。在结构上 HMGB包含三个特征性结构域，即两个具有相似结构及较高同源性的HMG box (A box和Bbox)，以及一个富含天冬氨酸和谷氨酸的酸性C末端。在细胞核内HMGB行使“DNA伴侣”的功能，能通过与多种转录因子、复制蛋白和甾体受体作用，参与DNA的重组、修复、基因转录调控、细胞复制及分化成熟等生命活动。此外，目前的研究表明，HMGB能在特定条件下释放到细胞外，介导多项炎症反应，是一种重要的前炎症细胞因子和趋化因子，可作为一种“预警信号”调控机体免疫，是细胞内核酸介导的天然免疫反应的普适性哨兵。并且HMGB与多项炎症疾病如脓毒症、关节炎、胰腺炎、动脉样硬化(Kalinina et al.，2004)等发生发展密切相关，是治疗脓毒症等炎症疾病的重要‘靶分子’，而其抗体可以显著降低患脓毒症等炎性疾病的小鼠死亡率。牡蛎是重要的海水养殖经济贝类，具有“海洋牛奶”之美誉，其肉质细嫩、肉味鲜美、营养价值高，是世界性的水产佳肴。我国是水产大国，牡蛎等贝类养殖是我国海水养殖的支柱产业之一，其中我国牡蛎养殖年产量居世界首位，达到300多万吨(湿重)，占我国海水养殖总产量(约1000万吨)的约三分之一(联合国粮农组织(FAO)统计数据)。牡蛎养殖业的迅速发展为我国农业经济作出了重要的贡献，也极大的改善了沿海渔民的生活水平，但是近年来，随着牡蛎种质退化，养殖规模的不断扩大，养殖环境的恶化和养殖模式的局限性，牡蛎养殖病害频发，造成了巨大的经济损失，极大的损害了当地渔民养殖积极性，限制了牡贩产业进一步的发展。其中研究证实类立克次体(rickettsia-like organism,简称RL0)是其主要病原之一，因此研究牡蛎抗RLO感染相关细胞因子及其抗感染机制显得尤为重要和迫切，将有助于牡蛎抗感染免疫制剂的开发。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中存在的不足之处，提供HMGB基因、蛋白及其在制备近江牡蛎抗感染免疫制剂中的作用为解决技术问题，本专利技术是通过这样的技术方案来实现的提供一种近江牡蛎HMGB基因编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本专利技术还提供了一种编码前述蛋白质的基因编码框，该基因的编码框核苷酸序列如 SEQ ID NO. I 所示。本专利技术还提供了所述蛋白质在制备近江牡蛎抗感染免疫制剂中的应用，是将所述蛋白质免疫新西兰大白兔进而获得多克隆抗血清。本专利技术还提供了前述蛋白质制备的多克隆抗血清(即HMGB蛋白的多克隆兔抗体)在抑制近江牡蛎病原RLO和革兰氏阴性细菌细胞壁成分——脂多糖(Lipopolysaccharide,简称LPS)引起的炎症反应及细胞坏死和细胞凋亡中的应用。本专利技术的有益效果在于本专利技术获得了近江牡蛎HMGB基因编码框全序列，并通过构建原核表达载体，表达并纯化了可溶性的HMGB蛋白质产品，并制备了其多克隆兔抗血清。其多克隆兔抗血清具有抑制近江牡蛎病原RLO和革兰氏阴性细菌LPS引起的炎症反应及细胞坏死和细胞凋亡的作用。具体实施例方式本专利技术的下述实施例所使用分子生物学的方法均为已知的技术。本专利技术中的近江牡蛎HMGB基因编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO 2所示。编码前述蛋白质的基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本专利技术所述蛋白质在制备近江牡蛎抗感染免疫制剂中的应用，是将所述蛋白质免疫新西兰大白兔进而获得多克隆抗血清。该多克隆抗血清(即HMGB蛋白的多克隆兔抗体)应用在抑制近江牡蛎病原RLO和革兰氏阴性细菌细胞壁成分——脂多糖(Lipopolysaccharide,简称LPS)引起的炎症反应及细胞坏死和细胞凋亡。本专利技术的实现步骤包括I、以近江牡蛎血淋巴细胞总RNA为模板，构建cDNA文库，获得HMGB的基因编码框核苷酸序列。2、利用DNA重组技术将HMGB基因编码框的序列片段克隆到合适的pMD19_T载体(Takara公司，日本)中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET_32 (a)原核表达载体(Novagen公司，德国)连接，获得重组表达质粒pET_32 (a) -HMGB。3、将阳性重组质粒PET-32 (a)-HMGB转化到表达宿主菌Ε· coli Rossetta (DE3)(Novagen公司，德国),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) (Sangon公司,力口拿大)诱导表达，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测。4、将阳性表达菌液扩大培养，利用蛋白质纯化试剂盒分离纯化重组蛋白质。5、培养近江牡蛎单层血淋巴细胞，并分别用LPS/RL0刺激，其中部分刺激添加HMGB多克隆兔抗血清，部分刺激添加HMGB免疫前的兔血清。 6、选择不同的时间点收集处理过的细胞，用荧光定量PCR检测炎症相关细胞因子LITAF (LPS-induced TNF-a factor，脂多糖诱导的肿瘤坏死因子α )的表达，用流式细胞仪检测血淋巴细胞坏死和凋亡。具体的操作步骤如下I、近江牡蛎血淋巴细胞cDNA文库的构建及筛选 提取近江牡贩血淋巴细胞总RNA,根据In-Fusion SMART cDNA libraryconstruction kit (BD Clotech公司)构建cDNA文库。利用M13引物对文库阳性质粒进行PCR扩增并测序。2、近江牡蛎HMGB编码框核苷酸全长序列的获得通过对文库筛选，我们得到一个和哺乳动物HMGB有较高同源性的基因，我们将其命名为Ca-HMGB (Ca代表近江牡蛎)。该基因的编码框核苷酸全长序列为SEQ ID NO :1。3、PET-32 (a) -HMGB 表达载体的构建以近江牡蛎cDNA为模板扩增目的片段，PCR扩增Ca-HMGB的反应条件为94°C预变性5分钟，然后35个循环(94°C变性30秒，51°C退火30秒，72°C延伸45秒)，72°C延伸10分钟。PCR产物分别连入PMD-19T载体，转化大肠杆菌DH5 a (Takara公司，日本)，涂布LBA筛选平板，挑取若干个克隆进行PCR鉴定及进一步的测序鉴定，将PCR阳性克隆 产物用BamHI、XhoI限制性内切酶(Takara公司，日本)双酶切，连接入经过同样双酶切的PET_32a载体的相应位点上，转化大肠杆菌DH5a (天根公司，中国)。PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体PET-32 (a) -HMGB。4、重组蛋白质的表达将阳性重组质粒PET-32(a)_HMGB转化表达宿主菌E. coli Rossetta (DE3 )感受态，涂布LBA平板，37°C培养过夜。挑取一个单克隆菌落，转入LBA培养液，37°C振摇培养过夜。取适量菌液，按1:100扩大培养至0D_为O. 4-0. 5时，将菌液分为若干等份，不加或分别加入IPTG，使其终浓度在0-1. O mmol/L,继续培养6小时，离心收集宿主菌。细菌经超声波裂解后(300W，20分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种近江牡蛎HMGB基因编码的蛋白质，其特征在于，该蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO 2 所示。2.用于编码权利要求I所述蛋白质的基因，其特征在于，该基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：许婷，吴信忠，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：