本发明专利技术公开了一种用于吸附抗体的蛋白A免疫吸附材料，是琼脂糖凝胶与蛋白A偶联的高分子材料，所述蛋白A是带有半胱氨酸的重组蛋白A；所述蛋白A免疫吸附材料通过重组蛋白A的制备、琼脂糖凝胶的活化、免疫吸附材料的合成三个步骤制备而成；本发明专利技术的蛋白A免疫吸附材料可从体液中直接、高效、选择性吸附自身免疫性疾病有关的致病抗体，且可安全地进行体外循环，实现一次性灌流即可达到清除患者致病抗体的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医用生物材料领域，具体涉及一种用于吸附抗体的蛋白A免疫吸附材料及其制备方法。
技术介绍
即使在医学发达的今日，人类仍有很多疑 难疾病无法攻克，自身免疫性疾病就是其中一种。自身免疫性疾病发病机制复杂，可累及全身多器官、多系统，传统治疗方法以糖皮质激素和细胞毒药物为主，治疗效果一直不佳。自身免疫性疾病已经成为威胁人类健康与生命的主要疾病之一。自身免疫性疾病以患者血清或其它体液中可检测到一种或多种高滴度的自身抗体为特点，自身抗体是诊断自身免疫性疾病的重要依据，每种自身自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗体谱，是早期诊断必不可少的生物学指标。病人血液中存在高效自身抗体是自身免疫性疾病的特点之一，也是临床确诊自身免疫疾病的重要依据。某些自身抗体因对疾病的诊断具有高度特异性，已成为诊断相应疾病的金标准，目前比较公认的标志性抗体有10多种,例如抗ds-DNA、抗Sm抗体仅发现于系统性红斑狼疮患者中；抗线粒体抗体(AMA-M2)是原发性胆汁性肝硬化的标志性抗体；抗角蛋白抗体是类风湿性关节炎的标志性抗体等等。因此，如果能够除去患者体内这些自身抗体，则有望抑制自身抗体对全身器官的攻击，缓解病情，减轻免疫抑制剂的用药量，使患者早日康复。蛋白A是某些金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质，其分子量为约42kD，其氨基末端含有4个高度类似的免疫球蛋白Fe段结合区，可与人血浆中的抗体及其免疫复合物的Fe段特异结合。如果将蛋白A固定在某一载体上制备成载体-蛋白A复合物免疫吸附柱，当人体血浆通过该吸附柱时，血浆中的抗体及其免疫复合物就会被特异性地吸附，一些因抗体和免疫复合物导致的疾病，如系统性红斑狼疮、自身免疫性疾病、器官移植、恶性肿瘤等即可得到治疗与缓解。1984年瑞典Excorim公司将蛋白A固定在琼脂糖凝胶(Sepharose CL-4B)上,用于吸附患者血浆中的致病抗体。该吸附材料每毫升可吸附20mg抗体，每支吸附柱一次可吸附I. 2g左右抗体(每支吸附柱填充62.5ml吸附剂)。一般而言，患者体内抗体总量为20 30g，为达到清除抗体的目的，该吸附柱必须反复多次吸附10次以上。为保证吸附柱重复、安全使用，该公司还生产了与免疫吸附柱配套使用的设备连续免疫吸附治疗监视与控制系统(CITEM 10)，由预制电脑程序控制两个吸附柱交替“吸附-再生-吸附”，循环进行，每支吸附柱与患者血浆反复接触、吸附10次，实现对致病物质清除的连续性和相对非受限性。目前，关于蛋白A免疫吸附材料合成方法的专利很多，一般情况下通过蛋白A分子链上的伯氨基与其它基团反应固定在琼脂糖凝胶基质上，由于伯胺基的化学反应活性不高，公开的文献和专利的实验数据显示，通过蛋白A上的伯氨基与载体反应后，固定在载体上的蛋白A含量为3 10mg/mL载体,合成得到的材料每毫升吸附10 25mg抗体，由于吸附柱对抗体的吸附能力不高，不能一次性灌流达到清除致病抗体的目的，吸附柱必须配套CITEM 10系统，这阻碍了蛋白A免疫吸附疗法在临床上的广泛应用。
技术实现思路
本专利技术提供一种高吸附性能的蛋白A免疫吸附材料及其制备方法。本专利技术的技术方案一种蛋白A免疫吸附材料，是琼脂糖凝胶与蛋白A偶联的高分子材料，所述蛋白A是带有半胱氨酸的重组蛋白A，其氨基酸序列为SEQ ID N0:1。所述固定在琼脂糖凝胶基质上的重组蛋白A含量为10_20mg/mL。所述的蛋白A免疫吸附材料的制备方法，包括以下步骤(1)、重组蛋白A的制备将一个半胱氨酸残基引入蛋白A的C端或N端，得到重组蛋白A ；(2)、琼脂糖凝胶的活化将琼脂糖凝胶与0. 2M高碘酸钠溶液混合，振摇反应，蒸馏水洗涤、抽干，得到活化琼脂糖凝胶；(3)、免疫吸附材料的合成将步骤⑴的重组蛋白A溶于0. lmol/L的硼酸缓冲溶液，然后与步骤(2)的活化琼脂糖凝胶混合，第一次振摇反应，蒸馏水洗涤、抽干，最后再加入含1%硼氢化钠的磷酸盐缓冲溶液，第二次振摇反应，蒸馏水洗涤、抽干，得到蛋白A免疫吸附材料。步骤(2)中琼脂糖凝胶与高碘酸钠溶液的重量比为I : 1-2。步骤(2)中振摇反应温度为室温、时间2-6小时、摇速50-200rpm。步骤(3)中重组蛋白A与活化琼脂糖凝胶的重量体积比为12-25mg/ml。步骤(3)中活化琼脂糖凝胶、硼酸缓冲溶液、磷酸缓冲溶液的体积比为1:1-2: 1-3。步骤(3)中第一次振摇反应和第二次振摇反应的温度为室温、时间2-6小时、摇速50-200rpmo步骤(3)中硼酸缓冲溶液PH值为9，磷酸盐缓冲溶液PH值为7. 4。一种吸附抗体的体外循环柱，体外循环柱填充所述的蛋白A免疫吸附材料。本专利技术的技术效果本专利技术通过基因工程的方法，将半胱氨酸引入到蛋白A的羧基末端(C端)或氨基末端(N端)，从而蛋白A带有反应活性更高的巯基(-SH)，与蛋白A本身带有的伯胺基相比，巯基反应活性更高，能够实现固定在琼脂糖凝胶基质的蛋白A含量达到10 20mg/mL载体，达到对抗体的吸附量为80mg/mL载体以上，本专利技术的免疫吸附材料可从体液中直接、高效、选择性吸附自身免疫性疾病有关的致病抗体，且可安全地进行体外循环，实现一次性灌流即可达到清除患者致病抗体的目的。具体实施例方式实施例I(I)、重组蛋白A的制备通过人工合成的方法获得带有半胱氨酸的蛋白A的编码序列(SEQ ID NO :1)，该序列包括天然蛋白A中EDABC结构域的序列，一个编码半胱氨酸的密码子tgt，分别位于序列5’端的限制性内切酶NdeI的识别序列和3’端XhoI的识别序列。SEQ ID NO 1gggcatatggcgcaacacgatgaagctcaacaaaatgctttttatcaagtcttaaatatgcctaacttaaatgctgatcaacgcaatggttttatccaaagccttaaagatgatccaagccaaagtgctaacgttttaggtgaagctcaaaaacttaatgactctcaagctccaaaaGctgatgcgcaacaaaataacttcaacaaagatcaacaaagcgccttctatgaaatcttgaacatgcctaacttaaacgaagcgcaacgtaacggcttcattcaaagtcttaaagacgacccaagccaaagcactaacgttttaggtgaagctaaaaaattaaacgaatctcaagcaccgaaaGctgataacaatttcaacaaagaacaacaaaatgctttctatgaaatcttgaatatgcctaacttaaacgaagaacaacgcaatggtttcatccaaagcttaaaagatgacccaagccaaagtgctaacctattgtcagaagctaaaaagttaaatgaatctcaagcaccgaaagcggataacaaattcaacaaagaacaacaaaatgctttctatgaaatcttacatttacctaacttaaacgaagaacaacgcaatggtttcatccaaagcctaaaagatgacccaagccaaagcgctaaccttttagcagaagctaaaaagctaaatgatgctc本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张旭锋，李树兴，
申请(专利权)人：云南澳敦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。