本发明专利技术公开了一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁C23蛋白质定位的免疫荧光方法。它是切取重金属处理后的植物根尖分生组织细胞，于4％多聚甲醛中固定1h；采用酶液酶解后；用滴管吸取约0.1ml样品液，均匀涂于载玻片上分散成单个细胞，标记后自然风干，放在1％TritonX-100浸泡15分钟；然后滴入15μl配好的一抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育1h；再滴入15μl配好的二抗，处理后滴加15μl??DAPI，最后滴加5μl防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用指甲油将盖玻片四周封好，1h后在荧光显微镜下观察。本发明专利技术的检测方法具有特异性高、实验结果准确，大大提高了观察细胞数目等特点。该方法为探讨重金属毒害细胞机理提供了精确的检测方法，其检测方法具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞生物学
，涉及一种快速检测重金属胁迫下核仁蛋白质变 化的定位方法。更具体的说是一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁C23蛋白质定位的免疫 荧光方法。该方法为研究重金属毒害植物细胞机理提供新的技术支持。
技术介绍
随着近代工业的发展，由此引发的环境污染问题日益突出。加之化肥和农药的不 合理施用，"三废"和城市生活垃圾的排放，加快重金属(As、 Cd、 Co、 Cr、 Cu、 Hg、 Mn、 Ni、 Pb、 Zn等)的污染物通过各种途径进入环境，并且通过食物链危害动物和人体健康，导致大气 和水环境质量的进一步恶化。目前，全球性的重金属污染状况日益严重，如何控制和减轻重 金属对环境的污染和危害，已成为环境、土壤及相关学科科学家们关注的热点课题。 一些研 究表明了低浓度重金属对植物的生长有积极的剌激作用，但当环境中重金属浓度过高，则 对植物的生长产生毒害作用，引发植物生理、生化的变化；抑制植物对营养元素的吸收；损 伤细胞结构；影响植物正常生长代谢。 核仁(nucleolus)是真核细胞间期核内高度紧密的结构，它是rDNA转录和核糖体 亚基组装的场所。核仁不仅是细胞内通讯和核糖体RNA加工的中心，随着细胞周期对细胞 增殖和衰老起重要的调控作用；一般来说，核仁的化学成分主要由DNA、 RNA、蛋白质和酶类 等组成。其中以蛋白质占干重的80%。 RNA约占干重的10X，多与蛋白质结合，以核蛋白的 形式存在。利用蛋白质组学方法已鉴定了 350中核仁蛋白，这些蛋白质与核仁的功能密切 相关。从生理生化、分子和细胞生物学手段，研究重金属对核仁蛋白质合成、分布及功能的 影响，已引起相关领域科学家的关注。本专利技术人利用此技术研究了不同重金属(Al、 Cd、 Cr、 Cu、 Hg、Mn、 Ni、 Pb、 Zn)胁迫对蚕豆、大蒜、洋葱及玉米等植物幼苗根尖细胞核仁的影响，这些研究结果表明重金属胁 迫能够损伤核仁结构，导致核仁中银染蛋白物质外溢到细胞质中。其他学者如李晓玲、张义 贤，用不同浓度氯化镍处理绿豆和大麦，通过银染的方法也观察到Ni2+能够诱导绿豆和大 麦根尖细胞核仁银染蛋白颗粒数量明显增加。因此，利用银染技术研究对重金属对植物细 胞核仁结构的影响，具有一定的科学价值。但是，银染技术只能鉴定重金属胁迫后，从细胞 核外溢到细胞质中的银染颗粒是核仁蛋白，不能鉴定是哪些种核仁蛋白受到重金属胁迫的 影响，对深入研究重金属毒害机理有一定的局限性。 近些年来，荧光免疫分析技术的发展尤为迅速，已在生命科学领域中广泛地用于 测定生长因子、蛋白质定位、核酸分析、神经递质等方面研究。核仁蛋白C23是真核细胞核 仁的重要的蛋白组份之一，在调控核糖体的生物合成与成熟，细胞增殖、生长、胚胎发生、胞 质分裂、染色质复制与核仁的发生等过程发挥重要作用。但是，利用免疫荧光技术研究重金 属胁迫对核仁周期过程中C23蛋白质的功能和动态变化的影响尚未见相关文献的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁C23蛋白质定位的免疫 荧光方法，为研究逆境胁迫下细胞中蛋白质定位及变化特征提供了简易、准确、快速的方法。 本专利技术人结合实验室前期工作，专利技术了一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁C23 蛋白质定位的免疫荧光方法。该技术的主要原理是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与 荧光标记技术结合起来，研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光 可在荧光显微镜下检出，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 特别是本专利技术涉及的压片方法的改革，能够提高观察细胞数目，可适用于其它细胞生物学 研究。为达到上述目的，本专利技术提供如下的技术方案 —种检测重金属胁迫下植物细胞核仁C23蛋白质定位的免疫荧光方法，其特征在 于，按如下的步骤进行 (1)切取重金属处理后的植物根尖分生组织细胞，于4%多聚甲醛中固定l-2h ;经 PBS缓冲液洗； (2)采用2. 5%纤维素酶+2. 5%果胶酶酶液于37t:温箱酶解；经PBS缓冲液洗涤 后压片； (3)将植物根尖转至离心管中，滴加PBS缓冲液，手摇震荡至多数细胞游离状态， 用滴管吸取约0. 1-0. 2ml样品液，均匀涂于载玻片上分散成单个细胞，标记后自然风干后 备用； (4)将(3)得到的载玻片放在1 % TritonX-100浸泡15-20分钟；经PBS缓冲液洗 涤； (5)在(4)得到的载片上滴入15-20 iU配好的一抗，盖上盖玻片，37t:温箱孵育 lh-l. 5h ;再经PBS缓冲液洗涤； (6)再将(5)得到的载片上滴入15-20 iU配好的二抗，盖上盖玻片，37t:温箱孵育 45min-lh ;经PBS缓冲液洗涤； (7)再将(6)的载玻片上滴加15-20 ii 1 DAPI，盖上盖玻片；经PBS缓冲液洗涤； (8)用滤纸吸干多余PBS，滴加5-10 ii 1防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用 指甲油将盖玻片四周封好，l-2h后在荧光显微镜下观察。 本专利技术所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁C23蛋白质定位的免疫荧光方法，其中步骤(2)中酶解所用时间是指在镜检时如果观察到大部分细胞均分散开，成一层球形原生质体，其中少量细胞的细胞质已经解体，只剩下细胞核时，即结束酶解。 本专利技术所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁C23蛋白质定位的免疫荧光方法，其中步骤(2)中所述的压片是指酶解后直接将样品制成悬浮液状态，然后，均匀地滴在载玻片上，不盖盖玻片，自然风干后备用。 本专利技术所述的PBS缓冲液洗是指采用PBS缓冲液洗3次，每次10-15分钟。 本专利技术所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁C23蛋白质定位的免疫荧光方法， 其中的一抗为鼠抗C23单克隆抗体，其浓度为0. 2mg/ml。 二抗为TRITC-山羊抗鼠IgG其 浓度为1. 5mg/ml。 本专利技术所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁C23蛋白质定位的免疫荧光方法， 其中DAPI (4， 6- 二胺-2苯基吲哚-二盐酸)的浓度为1 y g/ml。 本专利技术所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁C23蛋白质定位的免疫荧光方法， 其中的1% Triton X-100为聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)。 本专利技术所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁C23蛋白质定位的免疫荧光方法， 其中的防淬灭剂为lOXlml。 本专利技术所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁C23蛋白质定位的免疫荧光方法， 其中的重金属为Al、 As、 Cd、 Co、 Cr、 Cu、 Hg、 Mn、 Ni、 Pb或Zn。优选As、 Cd、 Co、 Al、 Cr、 Cu、 Hg，特别优选Al、Cd和Pb。 本专利技术的检测重金属胁迫下植物细胞核仁C23蛋白质定位的免疫荧光方法，其中 所述的植物细胞包括蚕豆、洋葱、玉米和洋葱根尖细胞中核仁C23蛋白质的变化。 本专利技术酶解所需的时间，要根据样品酶解的具体情况而定。根据本专利技术人的经验， 在镜检时观察到大部分细胞均分散开，成一层球形原生质体，其中少量细胞的细胞质已经 解体，只剩下细胞核时结束酶解，获得的效果最佳。酶解后直接将样品制成悬浮液状态，然 后，均匀地滴在载玻片上，不用盖盖玻片，自然风干后备用。这种方法减去了常规压片中盖 片和揭本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁Ｃ２３蛋白质定位的免疫荧光方法，其特征在于，按如下的步骤进行：（１）切取重金属处理后的植物根尖分生组织细胞，于４％多聚甲醛中固定１－２ｈ；经ＰＢＳ缓冲液洗；（２）采用２．５％纤维素酶＋２．５％果胶酶酶液于３７℃温箱酶解；经ＰＢＳ缓冲液洗涤后压片；（３）将植物根尖转至离心管中，滴加ＰＢＳ缓冲液，手摇震荡至多数细胞游离状态，用滴管吸取约０．１－０．２ｍｌ样品液，均匀涂于载玻片上分散成单个细胞，标记后自然风干后备用；（４）将（３）得到的载玻片放在１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００浸泡１５－２０分钟；经ＰＢＳ缓冲液洗涤；（５）在（４）得到的载片上滴入１５－２０μｌ配好的一抗，盖上盖玻片，３７℃温箱孵育１ｈ－１．５ｈ；再经ＰＢＳ缓冲液洗涤；（６）再将（５）得到的载片上滴入１５－２０μｌ配好的二抗，盖上盖玻片，３７℃温箱孵育４５ｍｉｎ－１ｈ；经ＰＢＳ缓冲液洗涤；（７）再将（６）的载玻片上滴加１５－２０μｌＤＡＰＩ，盖上盖玻片；经ＰＢＳ缓冲液洗涤；（８）用滤纸吸干多余ＰＢＳ，滴加５－１０μｌ防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用指甲油将盖玻片四周封好，１－２ｈ后在荧光显微镜下观察。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘东华，张慧敏，张闪闪，秦蓉，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：12
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