用于血液净化的蛋白A免疫吸附材料及其合成方法技术

本发明专利技术属于生物分离工程领域，涉及到用于血液净化的免疫吸附材料的合成方法。其特征为：用Ｎ，Ｎ′－二羰基咪唑在室温、在丙酮溶液中活化琼脂糖凝胶，之后，与二氨基二丙基胺在丙酮溶液中反应，再与戊二醛交联，最终与蛋白Ａ进行偶联反应得到蛋白Ａ免疫吸附材料。该方法的优点是：克服了溴化氰活化法的毒性和不稳定性，使吸附材料对抗体和免疫复合物的吸附能力提高，降低了生产和使用成本，提高了安全性和可靠性。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物分离工程领域，特别涉及到一种用于血液净化的蛋白A免疫吸附材料的合成方法。血液净化是近20年来出现的新的临床治疗方法，主要是通过清除存在于血液中的致病物质实现治疗某些疑难病症的目的。其实质是生物分离技术在医学领域的应用。伴随生物分离技术的进步，血液净化技术也不断得到发展。免疫吸附疗法是血液净化的重要分支，是近年来兴起的一种治疗疑难病症的新方法，其特征是通过在体外建立的人体血液循环支路使血液通过免疫吸附柱吸附除去患者血液中的致病物质，净化人体内环境，达到治疗疾病的目的。免疫吸附柱中含有的免疫吸附材料可与血液中的致病物质特异结合，而对血液中的其它成分则无损害。由于免疫吸附疗法是直接从血液中去除致病物质，对于急危病人和恶性病症如癌症、艾滋病、自身免疫性疾病、内毒素休克等疗效显著，副作用小，是一个有很好应用前景的治疗方法。免疫吸附治疗的关键是免疫吸附柱的研制，具体的说就是免疫吸附柱中免疫吸附材料的合成。蛋白A(protein A)是某些金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质，其分子量为42000，其氨基末端有4个高度类同的Fc结合区，可与人血浆中的抗体及其免疫复合物的Fc段特异结合，蛋白A与抗体及其免疫复合物结合后又可被pH 2.3～2.5的酸性溶液解离。人类的很多疾病都是由抗体和免疫复合物引起的，如系统性红斑狼疮、血小板减少性紫癜、重症肌无力等，这些都是无法治愈的疑难病症，利用蛋白A与抗体和免疫复合物特异结合的特性从血液中除去这些致病物质，将明显的缓解病情。蛋白A只有固定在某一载体上才有可能用于临床治疗，所以蛋白A免疫吸附材料的合成技术至关重要。目前，临床上使用的蛋白A免疫吸附材料采用的基质是琼脂糖凝胶，与蛋白A的偶联方式为溴化氰活化偶联，这种合成方法的缺点在于(1)溴化氰是剧毒物质，合成过程对人体和环境危害较大；(2)实验已证实，用溴化氰方法偶联的蛋白基团容易脱落。这就意味着在治疗过程中将有部分蛋白进入人体，对病人产生较大的副作用。所以这一合成工艺不甚理想。本专利技术的目的在于设计、提供一种无毒、无害、偶联蛋白A效果好的新的合成方法取代溴化氰合成工艺。通过选择一种可快速与琼脂糖凝胶上羟基反应的带有稳定的功能基团的有机试剂，增加材料上可与蛋白A偶联的活性基团的密度；通过改善蛋白A与抗体及其复合物结合的微环境，提高材料的稳定性和吸附性能，从而减少临床应用的副作用，提高临床疗效。本专利技术的基本构想是选用N，N′-二羰基咪唑作为活化琼脂糖凝胶的试剂。N，N′-二羰基咪唑是一个具有很高反应活性的试剂，可与琼脂糖凝胶上大量存在的羟基快速反应，形成咪唑氨基甲酸盐，咪唑氨基甲酸盐可在温和的条件下与蛋白质上的氨基形成稳定的氨基甲酸盐。N，N′-二羰基咪唑活化的材料可以在非水溶剂中稳定几年，即使在水溶液中，其水解半衰期经测量也为几小时，远远高于溴化氰活化材料的几十分钟。为了避免N，N′-二羰基咪唑活化材料上活性基团的水解问题，反应最好在有机溶剂中进行，但由于大多数蛋白在有机溶剂中会变性，故接蛋白配基的反应只能在水溶液中进行。低的键合反应温度将极大地减慢水解速度。由于N，N′-二羰基咪唑活化材料上的活性基团在pH8.5-9.0、在室温情况下30个小时其活性将完全失去，活性的咪唑氨基甲酸盐将失去二氧化碳和咪唑，完全变成羟基，所以用N，N′-二羰基咪唑活化的琼脂糖凝胶直接与蛋白反应，将不存在残余的未反应基团，减少了非特异吸附。虽然活性的咪唑氨基甲酸盐材料与蛋白直接键合具有稳定性好、非特异性小的优点，但由于蛋白A是一个具有42000分子量的大分子，与其特异性结合的抗体及其复合物是几十万到上百万分子量的更大分子，蛋白A要保持其吸附能力，需要保证与固体材料键合后，其空间立体结构不变形，同时大分子抗体及其免疫复合物与蛋白A的接触也需要有足够的空间，蛋白A免疫吸附材料的微环境对其吸附能力的影响很大。如果在材料表面与蛋白A之间加入一定长度的间隔臂，使蛋白A与材料表面保持一定的距离，将保证其立体空间结构不变，使固定化后的蛋白A有很好的柔性和足够的空间，有利于与抗体和免疫复合物的键合，材料上蛋白A吸附效率的提高，使得在免疫吸附柱吸附容量一定的情况下，蛋白A的用量减少。由于在免疫吸附材料的生产中，蛋白A的费用占整个生产成本的90％，蛋白A用量的降低将使生产成本减少很大幅度，有更大的经济效益和社会效益。二氨基二丙基胺可与咪唑氨基甲酸盐材料在有机溶液中反应，形成带有活性氨基的材料，所以选用二氨基二丙基胺作为间隔臂反应的第一步，可极大地减少咪唑氨基甲酸盐的水解，提高活性基团的含量，另外二氨基二丙基胺是一个亲水性的间隔臂，将减少材料表面的非特异性吸附。间隔臂分子的长度对材料上固定的蛋白A活性影响很大，间隔臂过短，不利于蛋白A活性的发挥，间隔臂过长易发生间隔臂折叠现象，15-18个原子的中等长度的间隔臂为最适。戊二醛一端可与材料上的氨基作用，另一端可与蛋白A上的氨基反应，是一个很好的交联剂，所以这里采用二氨基二丙基胺和戊二醛作为间隔臂分子(15个原子长)。由于空间的障碍，大分子的蛋白A与带间隔臂的材料反应后，将还有一些未反应的活性基团，这些基团是产生非特异吸附的潜在因素。必须将其惰性化。可以采用一端是氨基，另一端是羟基或其它惰性基团的小分子作为封闭试剂。这里任选羟基甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸乙酯盐酸盐和乙醇氨其中的一种作为封闭试剂。基于以上叙述，本专利技术的显著优势和效果是(1)选用N，N′-二羰基咪唑作为活化琼脂糖凝胶的试剂，克服了溴化氰活化的毒性和不稳定性，从而增加了合成的安全性，延长了材料的使用寿命；(2)选用N，N′-二羰基咪唑作为活化琼脂糖凝胶的试剂，增加了可与蛋白A键合的活性基团的含量，提高了单位体积吸附抗体及抗体抗原复合物的数量；(3)通过在活性材料表面和蛋白A之间引入间隔臂，为蛋白A与抗体及抗体抗原复合物的结合创造了足够的空间，改善了材料的微环境，从而提高了蛋白A的活性和对抗体及抗体抗原复合物的结合效率，减少了蛋白A的用量，降低了生产成本。以上的优势在临床治疗上将表现为降低病人的治疗费用，同时治疗时间缩短，安全性、可靠性增加。以下详述本专利技术的最佳实施例实施例1含有咪唑氨基甲酸盐的活性琼脂糖凝胶(Sepharose CL-4B)的合成在装有搅拌器、冷凝器的5L三口烧瓶中，加入琼脂糖凝胶(Sepharose-CL 4B)1升，加入分析纯丙酮试剂，使凝胶的含量保持在30-50％的比例，搅拌均匀，加入50-100克/升的N，N′-二羰基咪唑，在室温下搅拌活化1小时。结束反应，将凝胶过滤，用几倍体积的溶剂冲洗以移走活化过程中产生的咪唑，过滤，将活化好的介质置于丙酮中，储存4℃备用。用这种方法活化的凝胶每毫升至少有100μmol的咪唑氨基甲酸盐活性基团用来键合配基。实施例2带有二氨基二丙基(DAPDA)的琼脂糖凝胶(Sepharose-CL 4B)的合成在装有搅拌器、冷凝器的5L三口烧瓶中，加入带有咪唑氨基甲酸盐的琼脂糖凝胶(Sepharose-CL 4B)1升，将200克的二氨基二丙基(213ml)溶于1000毫升的丙酮中，然后加入到三口烧瓶中。在室温下搅拌反应3小时。用1升丙酮冲洗凝胶移走未反应的二氨基二丙基，然后分别用水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于血液净化的蛋白Ａ免疫吸附材料的合成方法，其特征在于： 以琼脂糖凝胶为基质，与Ｎ，Ｎ′－二羰基咪唑反应，得到带有咪唑氨基甲酸盐的活性材料，用二氨基二丙基胺和戊二醛作为间隔臂分子，与蛋白Ａ进行反应，得到蛋白Ａ免疫吸附材料。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：贾凌云，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]