本发明专利技术涉及一种来自葡萄冠瘿病拮抗菌水生拉恩氏菌的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra及其应用，具体涉及一种利用功能互补法从来自葡萄园中对葡萄冠瘿病具有拮抗作用的水生拉恩氏菌(rahnella?aquatilis)编码的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合酶)基因，以及该基因转化到植物后在提高植物对草甘膦除草剂抗性中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属微生物领域，涉及一种来自葡萄冠瘿病拮抗菌水生拉恩氏菌的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra及其应用，具体涉及一种利用功能互补法从来自葡萄园中对葡萄冠瘿病具有拮抗作用的水生拉恩氏菌(rahnella aquatilis)编码的5_烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合酶)基因(AroA-Ra)，以及该基因转化到植物后在提高植物对草甘膦除草剂抗性中的应用。
技术介绍
除草剂消灭杂草而不伤害作物的选择性是很难获得的特性，因为除草剂所影响的植物生理生化过程，如光合作用和氨基酸的生物合成，对作物和杂草是共同的。作物栽培种和近缘种通常不具有抗除草剂的特性，通过常规育种方法选育抗性作物品种有很大的困难。利用现代分子生物学技术，将其它物种中控制耐受和分解除草剂的基因分离出来，然后遗传转化到作物，便有可能获得抗除草剂的作物品种。目前至少有两类功能不同的抗除草剂基因应用于转基因作物上。第一类是通过降低植物酶对除草剂的敏感性减少除草剂对植物的杀伤能力。例如aroA的突变基因合成的 5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合酶)的脯氨酸被丝氨酸所取代，酶活力不受影响，但是对非选择性除草剂草甘膦的结合力只有原来的25%，从而使植物对除草剂表现不敏感。第二类则是通过解除除草剂对植物酶的抑制实现对除草剂抗性。例如Bar基因， 能合成乙酰转移酶，解除选择性除草剂草胺膦对植物谷氨酰胺酶的抑制，避免植物细胞因为氨的积累而死亡。常用的抗除草剂基因包括EPSP合酶基因(产生5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘磷)、G0X基因(产生草甘膦氧化酶，降解草甘膦)>bar基因(产生草胺膦乙酰转移酶，抗草胺膦)、BXN基因(产生溴苯腈水解酶，抗溴苯腈)等。草甘膦的杀草原理是它能抑制芳族氨基酸的合成，从而导致杂草死亡。草甘膦阻止芳族氨基酸合成的具体部位是抑制EPSP合酶。常规作物的EPSP合酶对草甘膦很敏感，如果直接接触，草甘膦会杀死常规作物。将编码降解草甘膦的蛋白或草甘膦低敏感的 EPSPS转化到作物中，明显提高作物抗草甘膦除草剂的能力，2005年统计显示美国87%大豆，61%棉花和玉米为抗草甘膦转基因植物。EPSP合酶广泛存在于自然界中，目前从不同植物中和微生物中筛选到很多类型的EPSP合成酶基因，但是大多数EPSP合酶对草甘膦敏感，通过突变可以使EPSP合成酶对草甘膦敏感性降低，然而它与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的亲和力也随之降低，从而导致酶活力下降，如来源于大肠杆菌的EPSP合酶基因，通过T42M、G96A、T97I、P101L、PlOlT和 A183T位点突变，均能降低该酶对草甘膦敏感性，但相对酶活力也随之下降，因而尚不能商业化。主要的耐草甘膦作物(商品名叫Roundup Ready作物)含有从微生物转化到作物中的CP4EPSPS基因。该基因来源于农杆菌CP4菌株(Agrobacterium sp. strain CP4)。 CP4EPSPS属于II型EPSPS，有不同于植物EPSPS基因的核苷酸顺序，转录翻译后的EPSP合成酶对草甘膦不再敏感，因而具有对草甘膦的耐药性，其催化活性介于植物和大肠杆菌之间。研究表明，第100位的丙氨酸在该酶感受草甘膦中起很大作用，将该位点突变为谷氨酸，对草甘膦敏感性恢复。有些耐草甘膦玉米含有被改变了的并来自玉米的EPSPS基因，由这个改变了的基因转录翻译后的EPSPS合成酶对草甘膦也不敏感，所以对草甘膦也有耐药性，但是这些基因表达的蛋白活性不强，必须通过超量表达来弥补。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题之一，在于提供一种抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra，该基因来源于葡萄冠瘿病拮抗菌中筛选获得的一株能在200mM草甘磷中生长的水生拉恩氏菌。本专利技术所要解决的技术问题之二，在于提供所述抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra在转化到植物后在提高植物对草甘膦除草剂抗性中的应用。本专利技术所述的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra，源自于水生拉恩氏菌，编码一个 5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，其核苷酸序列如SEQ ID Nol所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNo 2所示。所述的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra的获取方法为利用含高浓度草甘磷 (200mM)的M9培养基，从犯冠瘿病的葡萄根际微生物中，选择生长良好的菌株；再将选择出来的菌株置于LB液体培养基中培养12小时以上；之后提取总DNA，用0. 02-0. 5u/μ L浓度限制性核酸内切酶Sau3A酶切提取所得的总DNA，时间20-60分钟，并将酶切片段连接到表达载体pG251 (CN1338515NCBI)中，将连接物转化到EPSP合酶缺失的大肠杆菌菌株ER2799 中，筛选抗草甘磷的菌株。所述的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra的获取方法，具体包括如下步骤1、菌种分离称取草甘瞵频繁使用葡萄园中犯有冠缨病的葡萄根样品lg，加入0. 9% (w/v)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混勻，3000转/分轻离心，倒掉上清，再加入0. 9% (w/v)氯化钠溶液Iml，5000转/分震荡混勻，冰上IOmin静置，吸取150 μ 1溶液涂布与含有60mM 草甘瞵的LB固体培养基中培养Mh。将筛选获得的菌株在LB培养基中，28°C培养48h，在培养皿盖上加入3mL三氯甲烷，培养皿倒置12-15小时后，将培养好的根癌农杆菌菌株配成悬液，菌浓度为108-109/mL，吸取50 μ 1的培养液加入5mL融化后冷却到50°C的YEB培养基混勻后，立即倒入三氯甲烷杀死的筛选菌落培养皿中，铺成均勻的薄层，28°C培养Mh，观察并调取具有抑菌圈的菌株，即得到所述的水生拉恩氏菌株。2、总 DNA 提取将分离获得的细菌单株在液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl,10g/L 胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7. 5)中培养过夜(16小时)，菌体培养液以6，OOOg重力加速度离心5min，得到菌体沉淀。先将这些沉淀在-20°C下冷冻lh，之后使用TE缓冲液(IOmM Tris-HCl,lmMEDTA, pH 8.0)清洗一次，然后悬浮于浓度为10mg/mL溶菌酶的无菌水中， 37 °C摇床培养Ih。接着向培养液中加入0. 5M EDTA, 10% (w/v) SDS和浓度为5M的NaCl并轻轻振荡混勻后，再加入浓度为20mg/mL蛋白激酶K，37°C培养lh。用与培养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚氯仿异戊醇05 24 1，体积比)提取DNA ；水相用与相当水相体积 1/2(0. 5倍体积)的氯仿异戊醇04 1，体积比)萃取，振荡混勻后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体积)的异戊醇，振荡混勻后离心15min。取沉淀，用70% (ν/ν) 酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。所得总DNA于4°C保存。3、抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra的获取与筛选(Nucleic Acids Research, 2004, 32，e98)用0. 02-0. 5ιι/μ L浓度限制性核酸内切酶Sau3A酶切提取所得的成团泛菌总DNA， 时间20-60分钟，然后0.7% (w/v)琼脂糖凝胶电泳，切下长度为5-71Λ的DNA片段，用胶试剂盒本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚泉洪，彭日荷，熊爱生，付晓燕，田永生，赵伟，金晓芬，韩红娟，陈晨，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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