本发明专利技术包含用于在人类中减少草酸盐的方法和组合物，以及用于纯化和分离重组的减少草酸盐的酶蛋白的方法。本发明专利技术提供了用于以粒子组合物递送减少草酸盐的酶的方法和组合物。本发明专利技术的组合物适合于治疗或预防草酸盐相关病症的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及包含减少草酸盐的酶的喷雾干燥的粒子，所述粒子用于将活性形式的酶递送至胃，减少草酸盐的酶在那里发挥其作用。因而，本专利技术提供了用于减少胃中的草酸盐的手段。此外，本专利技术涉及分离重组蛋白的方法，所述重组蛋白在宿主细胞的细胞质中不溶，并且不作为被视为无活性、错误折叠的蛋白沉淀物的包含体存在，所述方法包含a)将不作为包含体存在的不溶性重组蛋白与可溶性宿主细胞蛋白分离开；以及b)溶解分离的重组蛋白。
技术介绍
肾/尿路结石疾病(尿石症)是世界范围内的主要健康问题。大多数与尿石症相关的结石由单独的草酸钙组成，或由草酸钙加磷酸钙组成。其他疾病状态也与过量草酸盐有关。他们包括外阴痛、与终末期肾病相关的草酸盐沉着症、心脏传导障碍、克罗恩病 (Crohn，s disease)以及其他肠道疾病状态。草酸和/或其盐、即草酸盐，发现于各种不同食物中，并因而是人类和动物膳食中许多组分的成分。在食用了含有增加量草酸的食物后可能会发生草酸盐吸收增加。众所周知，诸如菠菜和大黄的食物含有大量草酸盐，但是大量其他食物和饮料也含有草酸盐。因为草酸盐存在于如此多样的食物中，因此草酸盐含量低并且同时也可口的食物难以配制出来。此外，依从低草酸盐的膳食常常也是成问题的。形成肾结石的风险围绕着大量尚未完全理解的因素。在西方国家中，在多达12% 的人群中发生肾或尿路结石疾病，并且这些结石中约70%由草酸钙或草酸钙加磷酸钙组成。一些个体(例如患有诸如克罗恩病、炎性肠病或脂肪痢的肠道疾病的患者，以及已经历空肠回肠绕道术的患者)在其膳食中吸收了比其他个体更多的草酸盐。对于这些个体来说，草酸盐尿石症的发病率显著增加。发病率的增加是由于肾脏和尿液中草酸盐水平的增加，并且这种在人类中最常见的高草酸盐尿综合征被称为肠原性高草酸盐尿。在患有终末期肾病的患者中草酸盐也是问题，并且近来有证据表明尿液草酸盐升高也涉及到外阴前庭炎(外阴痛)。已经建议将包含减少草酸盐的细菌的肠溶包衣的或其他组合物，用于在通过肠道期间在被系统吸收之前降低草酸盐浓度。肠溶包衣组合物以完整形式通过胃，即包衣是完整的，因此不在胃中降解草酸盐。更好的方法是在草酸盐在肠道中被吸收之前，在胃中减少草酸盐。因此，对于开发能够减少胃中的草酸盐以便减少例如膳食草酸盐的组合物，存在着需求。此外，这样的组合物适用于治疗肠原性和吸收性高草酸盐尿，例如引起复发性结石病的高草酸盐尿。这种治疗的目的是使患者具有正常或至少降低的尿液草酸盐水平。专利技术概述本专利技术涉及包含草酸盐降解酶的喷雾干燥的粒子。喷雾干燥的粒子适用于药物和 /或食品组合物，用于将活性形式的酶递送至胃并在胃中降解草酸盐。因此，本专利技术还提供了通过给药喷雾干燥的粒子或包含它们的组合物来治疗和预防草酸盐相关病症的方法。本专利技术还提供了用于分离和纯化在宿主细胞的细胞质中不溶或仅仅微溶、并且不作为宿主细胞的包含体存在的重组蛋白的方法。重组蛋白尤其是重组的草酸盐降解酶。附图说明图I是通过分段梯度盐洗脱从苯基-琼脂糖凝胶柱洗脱的野生型OxDC的色谱图。 峰I和峰2都含有OxDC，但是峰I含有80-90 %的OxDC，具有较高比活性(50_60U/mg纯 OxDC)，而峰2含有30-70 %的OxDC,具有较低比活性(30_50U/mg纯OxDC)。峰2中的OxDC 据推理是受损或不正确折叠的。峰3是杂质(峰1-3在虚线曲线上标出)。不同曲线用点、 三角形、正方形、菱形和十字标出。图2是显示喂食Omg草酸盐(基线，无ox)、2. 3%草酸钾(HOD)和联合的本专利技术的草酸脱羧酶粒子(Oxazyme)与2. 3%草酸钾的大鼠的草酸盐平均尿液排泄的图。尿液草酸盐针对肌酸酐进行归一化，并且其是从第4至9日收集的累积尿液。Ox/Cr是草酸盐/肌酸酐。专利技术详述正如上面显示的，本专利技术提供了 i)用于分离和纯化重组蛋白、尤其是草酸盐降解酶的方法，ii)包含一种或多种草酸盐降解酶的喷雾干燥的粒子，以及iii)包含这样的粒子的组合物。因此，本专利技术是以前描述的用于治疗草酸盐相关疾病的组合物和方法的进一步发展，以前的组合物和方法参见例如WO 2007/075447(属于同一申请人)。此外，本专利技术人令人吃惊地发现，野生型草酸脱羧酶的特定突变、尤其是用丝氨酸、丙氨酸或精氨酸代替383 位中的半胱氨酸残基，使酶具有在酶的分离和纯化中特别有利的物理化学性质。因此，本专利技术的分离和纯化方法包含比正常情况下看到的更少的步骤，并利用了酶在细胞质和纯化介质中的溶解度差异。此外，本专利技术人发现了将活性草酸盐降解酶递送至胃的更简单的解决方案。在WO 2007/075447(属于同一申请人)中，描述了含有具有一定草酸盐降解酶含量的粒子的组合物。粒子含有各种聚合物的组合，并通过多层聚合物和/或通过将聚合物交联来加强对胃中的胃蛋白酶和PH的抗性，从而针对胃中的严苛环境进行保护。然而，已经开发了更简单的解决方案，其利用了非常特殊的聚合物组、尤其是聚(甲基)丙烯酸酯与一种或多种草酸盐降解酶组合。粒子使用温和方法即喷雾干燥来制备。即使通过将酶掺入到喷雾干燥的粒子中可能不能完全保护酶抵抗胃中的环境，但本文的实施例显示出在喷雾干燥方法后和暴露于模拟胃环境后的显著活性。定义当在本文中使用时，术语“减少草酸盐的酶”旨在表示能够减少草酸盐的任何酶。 它本身可以减少草酸盐，和/或它可以在减少草酸盐的途径中起作用。在本专利技术的文本中， 术语“草酸盐”涵盖草酸和/或其任何盐(草酸盐)。本专利技术考虑到了使用任何已知的草酸盐减少或降解酶。在本专利技术的粒子、组合物和方法中使用的酶包括但不限于草酸氧化酶、草酸脱羧酶(缩写为OxDc)、草酰辅酶A脱羧酶或甲酰辅酶A转移酶或其组合，无论是天然的还是突变的。此外，作为草酸盐降解途径的替代物或参与草酸盐代谢途径、特别是草酸盐减少的其他酶、辅因子和辅酶，也可以单独涉及或与一种或多种上面提到的酶组合使用。在本专利技术的情形中，本专利技术所考虑到的不仅是该定义所涵盖的酶，而且包括编码减少草酸盐的基因和蛋白质的多核苷酸序列。本专利技术还考虑到这些酶的任何结合配偶体，并包括与所述酶结合或相互作用的抗体和抗体片段。酶可以通过从生物体分离来产生，它们可以被纯化，它们可以通过合成、半合成或通过重组手段制造，或者它们可以作为细胞裂解物使用。通常情况下，酶将作为纯化的重组蛋白使用。当在医学应用(作为药物)或食品(作为食品增补剂、功能食品或作为预防措施)中使用时，优选情况下所使用的一种或多种酶在纯度和活性方面是明确确定的。一般使用来自三种主要草酸盐降解酶类型的突变或野生型的一种或多种酶。草酸氧化酶在高等植物中表达，催化草酸盐向CO2的氧依赖性氧化，并伴有H2O2形成。该反应形成了当前用于检测尿液草酸盐水平的测定法的基础。已经开发出一种rOxOx三步纯化方法，用于从大麦根获得草酸氧化酶。该酶也存在于甜菜的茎和根、苋属植物的叶、高粱和许多其他谷物中。草酸脱羧酶(EC 4. I. I. 2)是第二种类型的草酸盐代谢酶。主要存在于真菌中。它已在几种真菌中报道和表征，例如抚孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)、黑曲霉 (Aspergillus niger)的某些株白腐真菌、杂色革盖菌(Coriolus versicolor)和本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：哈密特·司杜，李青山，阿隆·布莱克·科里，卡尔古斯塔夫·格兰德，
申请(专利权)人：奥克斯泰拉知识产权公司，
类型：发明
国别省市：
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