使用多羟基链烷酸酯合酶突变体制备乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的方法技术

本发明专利技术提供了能够合成乳酸酯聚合物(PLA)和乳酸酯共聚物(PLA共聚物)的多种多羟基链烷酸酯(PHA)合酶的突变体，以及使用所述突变体制备乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的方法。更具体而言，本发明专利技术提供了以SEQ?ID?NO：2、4、6或8表示的多羟基链烷酸酯合酶的突变体，以及使用所述合酶的突变体制备乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的方法。以SEQ?ID?NO：2、4、6或8表示的多羟基链烷酸酯合酶，通过影响合成乳酸酯聚合物的活性的氨基酸序列突变可以具有合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的活性，并且通过使用所述合酶的突变体可以分别产生具有不同特征的乳酸酯聚合物和共聚物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能够使用乳酰辅酶A(Iactyl-CoA)作为底物合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的多种多羟基链烷酸酯合酶的突变体。而且，本专利技术还涉及一种使用多羟基链烷酸酯合酶的突变体制备乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的方法，所述多羟基链烷酸酯合酶的突变体具有提高的合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的活性。
技术介绍
聚乳酸酯(PLA)是一种源自乳酸酯的常见生物可降解的聚合物，其非常适合作为用于医学用途或一般用途的聚合物。目前，PLA由微生物发酵制得的乳酸酯的聚合来制备， 但是，这种乳酸酯的直接聚合只能制备具有低分子量(1000 5000道尔顿)的PLA。有一种使用链偶联剂由乳酸酯的直接聚合制得的低分子量PLA聚合得到高分子量PLA的方法， 以合成具有至少100，000道尔顿的PLA。但是，上述方法的缺点在于，加入有机溶剂和链偶联剂使工艺更复杂，并且有机溶剂和链偶联剂还难以去除。作为目前商业化的制备高分子量PLA的方法，有一种在将乳酸酯转化为丙交酯之后通过该丙交酯环的开环缩合反应来合成PLA的方法。当通过化学合成由乳酸酯合成PLA时，可以容易地制得PLA均聚物，但是，具有多种单体组成的PLA共聚物的合成是困难的，且具有非常低的工业效率。同时，多羟基链烷酸酯(PHA)是一种在碳源过量但如磷、氮、镁和氧等其它营养物缺乏时，在微生物中作为能量或碳源储存物质积聚的聚酯。由于PHA与来源于常规石油的合成聚合物具有相似的物理性能，所以PHA被公认作为常规合成塑料的替代材料。为了在微生物中制备PHA，需要将微生物的代谢产物转化为PHA单体的酶和利用 PHA单体合成PHA聚合物的PHA合酶。另外，为了使用微生物合成PLA和PLA共聚物，需要该相同的体系，并且除了能够提供羟酰辅酶A的酶之外还需要一种能够另外提供乳酰辅酶 A的酶，所述羟酰辅酶A是原始PHA合酶的底物。即，这说明为了使用微生物有效地制备PLA和PLA共聚物，通过表达活化的类型而不抑制细胞生长来引入能够平稳地提供乳酰辅酶A的单体供给酶，以及能够有效地识别乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶是非常重要的。
技术实现思路
因此，本专利技术人研究了与来源于假单胞菌(Pseudomonas sp. ) 6-19、已经被用于常规体系的多羟基链烷酸酯合酶具有高度氨基酸序列同源性的多羟基链烷酸酯合酶。于是， 本专利技术人证明，乳酸酯聚合物和其共聚物可以通过如下方法高效率地制得在具有高度同源性的合酶中从四个典型的假单胞菌O^eudomonas)菌株克隆多羟基链烷酸酯合酶，然后制备改变能够影响乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的合成活性的氨基酸序列的突变体。因此，基于上述事实完成了本专利技术。本专利技术的一个目的是提供一种能够利用多种多羟基链烷酸酯合酶的突变体产生乳酸酯聚合物或其共聚物的重组微生物和一种使用该重组微生物制备乳酸酯聚合物或其共聚物的方法。为了实现上述目的，本专利技术提供一种使用乳酰辅酶A作为底物合成乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的多羟基链烷酸酯合酶的突变体，其中所述突变体具有在以SEQ ID NO 2, 4、6或8表示的多羟基链烷酸酯合酶的氨基酸序列中包含选自以下的至少一种突变的氨基酸序列a)E130D 和 Q481K ；b)E130D、S325T 和 Q481K ；c)E130D、S477F 和 Q481K ；d)E130D、S325T、S477F 和 Q481K ；和e)E130D、S325T、S477G 和 Q481K。此外，本专利技术提供一种编码多羟基链烷酸酯合酶的突变体的基因，一种含有该基因的用于合成乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的重组载体，一种用该重组载体转化的转化体和一种包括对该转化体进行培养的制备乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的方法。有益效果根据本专利技术的所有多羟基链烷酸酯合酶通过影响合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的活性的氨基酸序列突变可以具有合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的活性，然后当使用合酶的突变体时，可以分别产生具有不同特征的乳酸酯共聚物。附图说明图1显示构建重组表达载体的过程的图，该重组表达载体包含本专利技术的具有与来源于假单胞菌MBEL 6-19的多羟基链烷酸酯合酶高度氨基酸序列同源性的II型多羟基链烷酸酯合酶、来源于丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰辅酶A转移酶突变体 (Pct540Cp)和具有提高合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的活性、来自所述重组表达载体的多羟基链烷酸酯合酶的突变体；和图2显示以下的氨基酸序列的多重比对来源于用于本专利技术的假单胞菌MBEL 6-19的多羟基链烷酸酯合酶、来源于绿针假单胞菌O^seudomonaschlororaphis)的多羟基链烷酸酯合酶、来源于恶臭假单胞菌O^seudomonasputidEOKTM^的多羟基链烷酸酯合酶、来源于食树脂假单胞菌O^seudomonasresinovorans)的多羟基链烷酸酯合酶和来源于绿脓假单胞菌G^seudomonasaeruginosEOPAOl的多羟基链烷酸酯合酶，其中被推测为催化残基的氨基酸残基(Cyd96、Asp451和His479)以“*”标记，使底物特异性改变为乳酰辅酶 A的氨基酸残基(Glul30、Ser325、kr477和Gln481)分别以氨基酸序列中的编号标记。具体实施例方式本专利技术通过同时包含乳酰辅酶A供给酶基因和来源于绿针假单胞菌的多羟基链烷酸酯合酶基因(SEQ ID NO :1)、来源于恶臭假单胞菌KTM40的多羟基链烷酸酯合酶基因 (SEQ ID NO :3)、来源于食树脂假单胞菌的羟基链烷酸酯合酶基因(SEQ ID NO :5)或来源于绿脓假单胞菌PAOl的多羟基链烷酸酯合酶基因(SEQ ID NO :7)，提供一种具有产生乳酸酯聚合物及其共聚物的能力的重组微生物。本专利技术提供一种使用乳酰辅酶A作为底物合成乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的多羟基链烷酸酯合酶的突变体，其中所述突变体具有在以SEQ ID N0:2、4、6或8表示的多羟基链烷酸酯合酶的氨基酸序列中包含选自以下的至少一种的氨基酸序列a)E130D 和 Q481K ；b) E130D、S325T 和 Q481K ；c)E130D、S477F 和 Q481K ；d)E130D、S325T、S477F 和 Q481K ；和e) E130D、S325T、S477G 和 Q481K。E130D突变是指第130个氨基酸谷氨酸被天门冬氨酸置换；S325T突变是指第325 个氨基酸丝氨酸被苏氨酸置换；S477F突变是指第477个氨基酸丝氨酸被苯丙氨酸置换； Q481K突变是指第481个氨基酸谷氨酰胺被赖氨酸置换；S477G突变是指第477个氨基酸丝氨酸被甘氨酸置换。由于氨基酸序列中的上述突变，利用多羟基链烷酸酯合酶的突变体产生乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的活性可以新形成或提高。SEQ ID NO :2、4、6和8的氨基酸序列分别是指来源于绿针假单胞菌的多羟基链烷酸酯合酶的氨基酸序列、来源于恶臭假单胞菌KTM40的多羟基链烷酸酯合酶的氨基酸序列、来源于食树脂假单胞菌的羟基链烷酸酯合酶的氨基酸序列和来源于绿脓假单胞菌PAOl 的多羟基链烷酸酯合酶的氨基酸序列。本专利技术人证明当使用来源于上述四种假单胞菌菌株的PHA合酶的突变体时，使用乳酰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁宅镐，姜惠玉，李相烨，郑有景，
申请(专利权)人：LG化学株式会社，韩国科学技术院，
类型：发明
国别省市：