一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，包括：(1)浸提菊芋汁；(2)将上述菊芋汁稀释至7-100g/L的总糖量，补加氮源和无机盐获得发酵培养基，调节pH值至4.0-5.0，灭菌后备用；(3)以3-15vol％的接种量将彩绒革盖菌的菌丝体种子液接入发酵培养基培养2-6天；(4)待菌丝球形成时，加入终浓度为1-100mM的草酸诱导产生草酸脱羧酶，培养0.5-6天后获取菌丝体；(5)将上述菌丝体经冷冻后破碎，然后用醋酸缓冲液提取菌丝碎片，去除残渣，即得草酸脱羧酶粗酶液。本发明专利技术工艺简单，成本低，效率高；底物诱导产草酸脱羧酶不受抑制，产酶量稳定。

【技术实现步骤摘要】
一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法
本专利技术属于草酸脱羧酶的制备领域，特别涉及一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法。
技术介绍
草酸脱羧酶可以催化草酸脱羧形成甲酸和二氧化碳，因此在酶法检测草酸含量，降解工业废水中草酸盐，制备低草酸含量食品以及降低人体内草酸浓度等方面具有广阔的应用前景。彩绒革盖菌作为生产草酸脱羧酶的重要菌种，如何降低其培养成本，大量生产菌丝体，并诱导菌丝体合成草酸脱羧酶是一项重要课题。由于碳元素是生物体内含量最多的元素，因此碳源是培养基中用量最大的一种，占生物产品总成本的比例较高，所以通过利用低成本碳源替代目前使用的纯净葡萄糖能大幅度降低微生物的培养成本。菊芋，又名洋姜，是一种菊科向日葵属宿根性草本植物。菊芋栽培对土质和环境要求较低，耐寒耐旱能力强，繁殖能力强，耐储存，利于大面积栽培。我国现在菊芋主要用途为腌制咸菜食用，导致经济价值较低，不能大面积推广栽培。菊芋中富含菊糖等多糖，采用浸提的方式提取菊芋汁内菊糖等营养物质，制成菊芋汁培养基培养彩绒革盖菌制备草酸脱羧酶，可以降低产酶成本提高菊芋经济附加值，具有很好的经济效益。与菊芋具有类似营养成分的植物还有菊苣和大丽花，也可以制成培养基培养彩绒革盖菌制备草酸脱羧酶。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，该方法工艺简单，成本低，效率高；底物诱导产草酸脱羧酶不受抑制，产酶量稳定。本专利技术的一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，包括：(1)将菊芋在105℃汽蒸15-30min，然后按照1∶1-1∶10的质量比加水，匀浆得到菊芋浆；在30-120℃下浸提0.5-3h，过滤，离心，得到菊芋汁；(2)将上述菊芋汁稀释至7-100g/L的总糖量，补加氮源和无机盐获得发酵培养基，调节pH值至4.0-5.0，灭菌后备用；(3)以3-15％的接种量将彩绒革盖菌的菌丝体种子液接入发酵培养基，在10-30℃和100-250rpm条件下培养2-6天；(4)待菌丝球形成时，加入终浓度为1-100mM的草酸诱导产生草酸脱羧酶，培养0.5-6天后获取菌丝体；(5)将上述菌丝体经破碎或冷冻后破碎，然后用0.2M、pH3.7的醋酸缓冲液提取菌丝碎片，去除残渣，即得草酸脱羧酶粗酶液。所述步骤(2)中的发酵培养基中组分为：总糖为7-100g的菊芋汁，3.0g蛋白胨，1.0gKH2PO4，0.2gNa2HPO4·12H2O，0.5gMgSO4·7H2O以及微量元素1ml，以水定容至1L。所述步骤(3)中的菌丝体种子液的培养基组分为：7-50g葡萄糖，3.0g蛋白胨，1.0gKH2PO4，0.2gNa2HPO4·12H2O，0.5gMgSO4·7H2O以及微量元素1ml，以水定容至1L，。所述微量元素的组分为：FeSO4·7H2O10g，MnSO4·H2O1.0g，ZnSO4·7H2O1.0g，CuSO4·5H2O2.0g，CaCl2·2H2O13g，用水定容至1L。所述步骤(4)中的草酸加入方式为间歇式、分批补料式或连续式。所述步骤(5)中的破碎方式为研磨破碎、珠磨破碎、均质机破碎或超声破碎。所述步骤(1)中的菊芋为菊芋、菊苣、大丽花块茎等富含果聚糖的植物。所述步骤(1)中的菊芋汁可以被果聚糖或者果糖替代。本专利技术通过浸提菊芋汁获得培养彩绒革盖菌生长的碳源，并用底物草酸诱导菌丝体合成草酸脱羧酶。有益效果(1)本专利技术利用浸提菊芋汁作为发酵培养彩绒革盖菌的碳源，方法简单，易于操作；(2)本专利技术使用的菊芋产量大，成本低，作为生产碳源的原料价格低廉；且碳源的制备可控性强，含糖量稳定；(3)与传统培养基碳源——葡萄糖相比，以该低值碳源生产彩绒革盖菌获得的菌丝体生物量大，是葡萄糖碳源的5倍以上，转化率高；(4)与传统培养基相比，以该低值碳源培养菌体时，底物诱导产草酸脱羧酶不受抑制，产酶量稳定。附图说明图1为菊芋汁培养基(初始pH5.0)生产的菌丝体干重随发酵时间的变化；图2为不同糖浓菊芋汁培养基对菌丝体干重的影响；图3为不同糖浓菊芋汁培养基的转化率；图4为以草酸诱导菊芋汁培养基(初始pH5.0)生产的菌丝合成草酸脱羧酶的结果；图5为以草酸诱导菊芋汁培养基(初始pH5.0)生产的菌丝合成草酸脱羧酶后的总糖含量变化。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1菊芋汁生产彩绒革盖菌(培养基初始pH值5.0)将新鲜菊芋在105℃汽蒸15min，然后按照1∶1的质量比加水，匀浆得到菊芋浆。该菊芋浆在80℃下浸提1h，经过2层纱布过滤，8000r/min离心10min，得到菊芋汁，用苯酚硫酸法测定菊芋汁的总糖含量(以葡萄糖为标准糖计)，4℃条件下储存备用。每50mL发酵培养基中加入含1g总糖(以葡萄糖计)的菊芋汁，再加入0.15g蛋白胨，0.05g磷酸二氢钾，0.025gMgSO4·7H2O，0.01gNa2HPO4·12H2O，以及微量元素50μL(微量元素配方为：FeSO4·7H2O10g/L，MnSO4·H2O1.0g/L，ZnSO4·7H2O1.0g/L，CuSO4·5H2O2.0g/L，CaCl2·2H2O13g/L)。培养基配制完成后，用硫酸和氢氧化钠调节初始pH值至5.0，灭菌后备用。取一块琼脂平板菌种，用打孔器打下直径约10mm含菌丝体的固体培养基薄片，取2-3片加入液体种子培养基，30℃静置4-6天。待菌丝体在培养基上方形成白色菌盖但尚未完全浮出液面，全部移入装有玻璃珠的容器，进行震荡破碎，获得含有菌丝碎片的悬浊液。将混匀的菌悬液按8vol％的接种量接入发酵培养基中，培养1-5天，称取菌丝体绝干重。发现菊芋汁培养基的菌丝体产量高于对照培养基(葡萄糖)菌丝体产量，约高4-5倍，且处于上升趋势(见图1)。实施例2菊芋汁生产彩绒革盖菌(培养基初始pH值5.0)将新鲜菊芋在105℃汽蒸20min，然后按照1∶5的质量比加水，匀浆得到菊芋浆。该菊芋浆在90℃下浸提1.5h，经过2层纱布过滤，8000r/min离心10min，得到菊芋汁，用苯酚硫酸法测定菊芋汁的总糖含量(以葡萄糖为标准糖计)，4℃条件下储存备用。每50mL发酵培养基中加入含0.35g总糖(以葡萄糖计)的菊芋汁，再加入0.15g蛋白胨，0.05g磷酸二氢钾，0.025gMgSO4·7H2O，0.01gNa2HPO4·12H2O，以及微量元素50μL(微量元素配方为：FeSO4·7H2O10g/L，MnSO4·H2O1.0g/L，ZnSO4·7H2O1.0g/L，CuSO4·5H2O2.0g/L，CaCl2·2H2O13g/L)。培养基配制完成后，用硫酸和氢氧化钠调节初始pH值至5.0，灭菌后备用。取一块琼脂平板菌种，用打孔器打下直径约10mm含菌丝体的固体培养基薄片，取2-3片加入液体种子培养基，30℃静置4-6天。待菌丝体在培养基上方形成白色菌盖但尚未完全浮出液面，全部移入装有玻璃珠的容器，进行震荡破碎，获得含有菌丝碎片的悬浊液。将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，包括：（1）将菊芋在105℃汽蒸15-30min，然后按照1:1-1:10的质量比加水，匀浆得到菊芋浆；在30-120℃下浸提0.5-3h，过滤，离心，得到菊芋汁；（2）将上述菊芋汁稀释至7-100g/L的总糖量，补加氮源和无机盐获得发酵培养基，调节pH值至4.0-5.0，灭菌后备用；其中，发酵培养基中组分为：总糖为7-100g的菊芋汁，3.0g蛋白胨，1.0gKH2PO4，0.2gNa2HPO4·12H2O，0.5gMgSO4·7H2O以及微量元素1ml，以水定容至1L；（3）以3-15vol%的接种量将彩绒革盖菌的菌丝体种子液接入发酵培养基，在10-30℃和100-250rpm条件下培养2-6天；（4）待菌丝球形成时，加入终浓度为1-100mM的草酸诱导产生草酸脱羧酶，培养0.5-6天后获取菌丝体；（5）将上述菌丝体经破碎或冷冻后破碎，然后用0.2M、pH3.7的醋酸缓冲液提取菌丝碎片，去除残渣，即得草...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪枫，宫搏阳，杨雪霞，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：