β-葡聚糖内切酶PEGase-1基因及其表达产物和应用制造技术

本发明专利技术公开一种从多头绒泡菌分离的β-葡聚糖内切酶PEGase-1基因，该基因编码的蛋白由309氨基酸组成，其氨基酸序列与嗜热拟青霉有44％的同源性，模拟的三级结构呈β-三明治折叠卷状，属于糖苷水解酶的GH16家族成员。将该基因重组到表达载体上后分别转化到酵母和里氏木霉内，表达的蛋白能分泌到细胞外，该蛋白可以通过40％～70％的硫铵分级沉淀粗分离，可以通过HiTrapTMCaptoTM?Q离子交换层析胶纯化，并且能特异性的水解大麦β-1，3(4)-葡聚糖，其水解活力可在金属离子的存在下得到提高，从而可以应用于啤酒酿造，以及作为药品、食品和饲料添加剂。

【技术实现步骤摘要】
β-葡聚糖内切酶PEGase-1基因及其表达产物和应用
本专利技术涉及分子生物学，尤其涉及一种β-葡聚糖内切酶PEfeise-I基因及其表达产物和应用。
技术介绍
β-1,3 )-葡聚糖内切酶(Endo-β _1，3 ⑷-glucanase，Efeise,以下简称“ β-葡聚糖内切酶”，酶学分类号为EC3. 2.1.73)是一类能偶特异性的水解β-1,3 )-葡聚糖中与β_1，3糖苷键毗邻的β _1，4糖苷键的糖苷水解酶(glycosylhydrolases，GH)，水解产物通常为3 5个寡糖。大麦芽是啤酒生产的主要原料，大麦胚乳细胞壁约70%的组分为β-1，30)_葡聚糖。在啤酒酿造过程中，糖化过程变性的蛋白质会与过量的β-1，30)_葡聚糖结合会造成酵母早期沉积，从而影响发酵，并导致啤酒酿造过程中的双乙酰还原期延长；过量的 β-1,3 )-葡聚糖还会引起啤酒浑浊和沉淀，影响啤酒的品质。因此，啤酒在原料糖化后， 要添加适量的葡聚糖内切酶以水解原料中的β-1，30)_葡聚糖。麦片因纤维含量高、 营养价值高成为老年人喜爱的食品，但食用过量的麦片容易引起老年人消化不良，因此，在麦片中添加适量的β-葡聚糖内切酶或食用麦片后再食用几片含β-葡聚糖内切酶的多酶片可以有助于消化。玉米胚乳细胞壁中也含大量β-1，30)_葡聚糖，崽猪食用以玉米为主要原料的饲料时容易引起消化不良。因此，在饲料中添加适量的β-葡聚糖内切酶，让崽猪及早食用可消化的饲料，可以让崽猪及早断奶，从而提高生猪的生产效率。植物、真菌和细菌都含有β-葡聚糖内切酶，植物β-葡聚糖内切酶属于糖苷水解酶的GH17家族，而微生物β-葡聚糖内切酶则属于糖苷水解酶的GH16家族。尽管GH16和 GH17家族的β-葡聚糖内切酶有相似的功能，但他们在结构上却没有相似性，GH17家族成员的三级结构呈(β/α)8桶状，而GH16家族成员的三级结构则呈β-三明治折叠卷状 Μ。大麦β-葡聚糖内切酶在种子萌芽早期表达量最高，其最适PH值(pH。pt)为4. 6、最适温度(T。pt)为45°C 。芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶也能特异水解大麦β-1,3 )-葡聚糖，其pH。pt介于6.0 7.5、T。pt介于58°C 60°C ，但该类β-葡聚糖内切酶大多对酸环境敏感。浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶是最耐热的β-葡聚糖内切酶之一，T-为 65°C，在75°C时还有80%的活性，pH-为中性。淀粉液化芽孢杆菌的β-葡聚糖内切酶的 pH-为6.0，受酸性环境影响最小。用淀粉液化芽孢杆菌葡聚糖内切酶N端的16个氨基酸替换浸麻芽孢杆菌β -葡聚糖内切酶N端的16个氨基酸组合成的杂合酶Η(Α16-Μ) 在80°C时还有80%的活性，对酸性环境耐受能力有所提高，对大麦β-1，30)_葡聚糖的特异性还比野生型浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶还高40% ，但国内没有该类酶的知识产权，啤酒行业使用的β-葡聚糖内切酶目前主要依赖进口。真菌β-葡聚糖内切酶水解的底物比大麦和芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶广泛，不仅能水解大麦β-1，30)_葡聚糖，还能水解羧甲基纤维素和昆布多糖。尽管国内在芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶和真菌β-葡聚糖内切酶上也有一定的研究，但能替代进口产品的β-葡聚糖内切酶还没有出现。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种能够表达具有葡聚糖内切酶活性的蛋白的葡聚糖内切酶PEfese-I基因，并提供其表达产物及应用。一种β -葡聚糖内切酶PEfeise-I基因，包括如下序列(a)、编码由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；(b)、和编码由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸具有至少 98%同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；(C)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多肽由SEQ IDNo. 1所示的氨基酸序列组成，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有β -葡聚糖内切酶活性；或(d)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多肽与由SEQ IDNo. 1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98%的同源性。一种β-葡聚糖内切酶PEfeise-I基因，包括如下序列(a)、由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；(b)、和编码由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98%同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；或(c)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多核苷酸序列由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成，其中一个或多个密码子被缺失、替代或增加，所述多肽具有 β-葡聚糖内切酶活性。优选的，所述β -葡聚糖内切酶PEfese-I基因包括由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸。一种基因表达载体，包括上述的β-葡聚糖内切酶PEfese-I基因。一种宿主细胞，包括如上述的基因表达载体，所述宿主细胞为真核生物细胞。优选的，所述真核生物细胞为酵母细胞或里氏木霉细胞。一种蛋白质的制备方法，包括如下步骤步骤一、提供上述的宿主细胞，诱导表达得到表达液； 步骤二、利用40 %和70 %的饱和硫酸铵将所述表达液分级沉淀，分离粗产物；步骤三、利用HiTrap Capto Q离子交换层析胶纯化粗产物，得到所述蛋白质。一种蛋白质，包括如下序列(a)、由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)、和由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98%同源性的多肽；或(C)、由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有β -葡聚糖内切酶活性。一种酶制剂，包括上述的蛋白质；所述酶制剂用于水解β-1，30)_葡聚糖。优选的，所述酶制剂还包括用于提高酶活性的金属阳离子。从多头绒泡菌cDNA文库中筛选PSRI3K相关蛋白基因，分离出一段编码具有β-葡聚糖内切酶活性的β-葡聚糖内切酶类似蛋白的3' -cDNA片段。该3' -cDNA片段表达的β-葡聚糖内切酶类似蛋白具有如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列，该3' -cDNA片段具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。上述β -葡聚糖内切酶PEfese-I基因能够表达具有β-葡聚糖内切酶活性的蛋白质，表达产物可以应用于啤酒酿造，以及作为药品、食品和饲料添加剂。附图说明图1为PEfese-I与嗜热拟青霉的β -葡聚糖内切酶的氨基酸序列比对图。图2为模拟的嗜热拟青霉的β-葡聚糖内切酶与PEfese-I的三级结构示意图；其中，A为模拟的嗜热拟青霉β -葡聚糖内切酶的三级结构，B为模拟的PEfese-I的三级结构。图3为实施例2在大肠杆菌细胞内表达的Trx-PEGase-I与硫氧还蛋白标签蛋白进行SDS-PAGE后考马斯蓝染色的示意图。图4为实施例3在酵母细胞内表达的PEfese-I进行SDS-PAGE后考马斯蓝染色的示意图；其中，箭头指向表达的PEfese-1。图5为实施例4在里氏木霉细胞内表达的PEfese-I与阴性对照组同时进行 SDS-PAGE后考马斯蓝染色的示意图；其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种β－葡聚糖内切酶ＰＥＧａｓｅ－１基因，其特征在于，包括如下序列：（ａ）、编码由ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；（ｂ）、和编码由ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸具有至少９８％同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；（ｃ）、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多肽由ＳＥＱ　ＩＤＮｏ．１所示的氨基酸序列组成，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有β－葡聚糖内切酶活性；或（ｄ）、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多肽与由ＳＥＱ　ＩＤＮｏ．１所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少９８％的同源性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邢苗，刘士德，张建华，李小青，田生礼，欧阳秋玲，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：94