一种水飞蓟宾的检测方法技术

本发明专利技术属于医药领域，具体涉及一种水飞蓟宾的检测方法，本发明专利技术的方法，包括以下步骤：步骤1、含有水飞蓟宾A与水飞蓟宾B的血浆经沉淀蛋白预处理；步骤2、将经过预处理的血浆，经液-质联用仪，测定其中水飞蓟宾A与水飞蓟宾B浓度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种药物检测方法，特别涉及一种治疗肝病的药物水飞蓟宾的检测方法。
技术介绍
水飞蓟宾是菊科植物水飞蓟中提取分离得到的黄酮类化合物，具有保肝、护肝等功效。近年来药效学研究表明，水飞蓟宾还具有较强的抗炎，抗肿瘤活性。定天明等采用胶束电泳毛细管色谱法对水飞蓟宾的非对映体(水飞蓟宾A和水飞蓟宾B)进行了分离，从而证明了水飞蓟宾为两个非对映体的混合物，其化学结构见图1。目前，已有多篇文献报道了水飞蓟宾在动物和人体内的定量分析研究，但有关水飞蓟宾A和水飞蓟宾B各自的药动学研究报道极少。Rickling等采用高效液相色谱-电化学法(HPLC-ECD)测定人血浆中水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的浓度，但该方法的灵敏度低，且样品预处理较为繁琐，不能满足药动学研究需要。本实验建立了一种简单、快速、灵敏的LC-MS/MS方法，同时测定大鼠血浆中水飞蓟宾A和水飞蓟宾B浓度，并成功用于水飞蓟宾A和水飞蓟宾B各自的药动学及生物利用度研究。
技术实现思路
本专利技术建立一种简单、快速、灵敏的液-质联用法(LC-MS/MS)，该方法用于测定血浆中水飞蓟宾A与水飞蓟宾B浓度。本专利技术的方法，包括以下步骤步骤1、含有水飞蓟宾A与水飞蓟宾B的血浆经沉淀蛋白预处理；步骤2、将经过预处理的血浆，经液-质联用仪，测定其中水飞蓟宾A与水飞蓟宾B 浓度。优选的本专利技术的方法如下0. ImL血浆样品经沉淀蛋白预处理后，以甲醇-0. 1% 甲酸 08 52，ν/ν)为流动相，采Eclipse XDB-C18 色谱柱(150X2. 1 匪，5 μ m) 分离，以ESI源负离子模式、选择反应监测(SRM)方式进行定量分析。本专利技术的检测方法，其中水飞蓟宾A与水飞蓟宾B在血浆中的线性范围为 2.0-500001^.111171,最低定量限(LLOQ)为Z.Ong.mr1。药物的日内、日间精密度在9. 1 % 以内，准确度(相对误差)小于士5.7%。附图说明图1水飞蓟宾A (a)和水飞蓟宾B (b)的化学结构图2水飞蓟宾A(a)、水飞蓟宾B(b)和柚皮苷(c)的质谱3血浆样品色谱4水飞蓟宾A和水飞蓟宾B在大鼠体内的平均药-时曲线a-水飞蓟宾A，静脉注射13. 3mg/kg;b-水飞蓟宾A，灌胃给药13. 3，26.6 and 53. 2mg/kg ；C-水飞蓟宾B，静脉注射14. 7mg/kg;d-水飞蓟宾B，灌胃给药14. 7，29. 4 and 58. 8mg/kg.具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步叙述，以使公众对
技术实现思路
有更深入的了解，并非对本专利技术的限制，凡依照本专利技术公开内容所进行的任何本领域等同替换， 均属于本专利技术的保护范围。实施例11材料与方法1. 1药品与试剂水飞蓟宾A和水飞蓟宾B标准品(天津天士力集团研究院自制，纯度>98. 5%)； 内标柚皮苷(中国药品生物制品检定所，纯度> 99.0%，批号110722-200610)；水飞蓟宾胶囊(天津天士力制药股份有限公司，规格35mg水飞蓟宾/粒，批号090509)；乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)；其余试剂均为分析纯。1. 2 仪器Finnigan TSQ Quantum三重四极杆液-质联用仪(美国Finigan公司)；XW-80A 微型漩涡混合仪(上海卢西分析仪器厂有限公司)；TG 16W微量高速离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司)。1. 3色谱条件色谱柱ZorbaxEclipse XDB-C18 柱(150X 2. 1mm，5 μ m)，美国 Agilent 公司；流动相甲醇-0. 甲酸(48 52，ν/ν)；流速0. 25mL · min—1 ；柱温:30°C ；进样量=IOyL01. 4质谱条件离子源为电喷雾离子源，负离子方式检测；喷雾电压3800v ；毛细管温度390°C ；鞘气(N2)压力25Psi ；辅助气(N2)压力3psi ；碰撞气(Ar)压力为1. 4mTorr ；扫描方式为选择性反应监测(SRM)；碰撞能量(CE)分别为20eV(水飞蓟宾A和水飞蓟宾B)和34eV(柚皮苷)，用于定量分析的离子反应分别为m/z481. 1 — m/z 300. 9 (水飞蓟宾A和水飞蓟宾 B)和m/z 579.2 —m/z 271.1(柚皮苷)。水飞蓟宾Α、水飞蓟宾B和内标柚皮苷的二级全扫描质谱图见图2。1. 5实验动物与实验方案1. 5. 1实验动物Wistar大鼠，雄性，体重Q20 士 20) g(北京维通利华实验动物中心)。1. 5. 2静注、灌胃用水飞蓟宾溶液的配置精密称取水飞蓟宾140mg，溶于25mL聚乙二醇200 乙醇二纯水(5:2: 3,v/v/v)混合溶液中，即得水飞蓟宾静注溶液；分别取4，8和16粒水飞蓟宾胶囊，去壳，混悬于70mL 二纯水中，配置成水飞蓟宾低、中、高3个剂量的灌胃液。上述给药溶液均需现用现配。1.5.3给药及血样采集5只大鼠按^mg ^kg4静脉注射给予水飞蓟宾静注溶液(相当于水飞蓟宾A13. 3mg · kg—1，水飞蓟宾B14. 7mg · kg—1) ；15只大鼠分别按沘，56和lUmg^g—1灌胃给予低、中、高3个剂浓度的水飞蓟宾混悬液(相当于水飞蓟宾A13. 3，26. 6 和 53. 2mg · kg、水飞蓟宾 B14. 7，29. 4 和 58. 8mg · kg-1)。大鼠给药后 0,0. 17,0. 33，0. 67， 1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,12. Oh,经大鼠眼球后静脉丛采集静脉血约0. 3mL,置肝素化试管中，3500r · miiT1离心lOmin，分离血浆，置_20°C冰箱中冷冻保存待测。1. 6血浆样品预处理取血浆样品100 μ L置于1. 5mL Eppendorf管中，依次加入乙腈100 μ L，内标溶液 (200ng · mL-1柚皮苷溶液，乙腈配置)100 μ L，旋涡Imin,然后于12000r · mirT1离心8min, 取上清液 ο μ L进行LC-MS/MS分析。2 结果2. 1专属性考察由图3可见，在“1. 3”所述条件下，水飞蓟宾Α、水飞蓟宾B和内标的保留时间分别为6. 45，7. 35和2. 55min，且血浆中的内源性物质不干扰待测物与内标的测定。2. 2线性范围及灵敏度取大鼠空白血浆，加入水飞蓟宾A、水飞蓟宾B标准溶液，配制成含水飞蓟宾A和水飞蓟宾 B2，5，20，50，500，2000，20000 和 50000ng · ml/1 的血浆样品，按 “ 1. 6 ” 项操作， 记录色谱图；以血浆样品中待测物的浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W = 1/X2)最小二乘法进行回归运算，求得水飞蓟宾A的回归方程为Y = 0. 00125Χ+0. 00063 (r = 0. 9981)，水飞蓟宾 B 的回归方程为Y = 0. 00122Χ+0. 00096 (r =0. 9959)，本法水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的线性范围均为2 50000ng · mL1, LLOQ为 2ng · mL-1 (S/N > 10)。2. 3精密度与准确度取大鼠空白血浆若干份，分别加入水飞蓟宾A和水飞蓟宾B标准溶液，配置成水飞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水飞蓟宾的检测方法，包括以下步骤步骤1、采集含有水飞蓟宾A与水飞蓟宾B的血浆，经沉淀蛋白预处理；步骤2、将经过预处理的血浆，经液-质联用色谱仪，测定血浆中水飞蓟宾A与水飞蓟宾 B浓度。2.权利要求1的检测方法，其特征在于，所述色谱条件为色谱柱=ZortaxEclipse XDB-C18柱体积为150 X 2. Imm,粒径为5 μ m，美国Agilent公司；流动相甲醇-0. 1 %甲酸为 48 52 ；流速0. 25mL · mirT1 ；柱温:30°C ；进样量10μ L。3.权利要求1的检测方法，其特征在于，其中水飞蓟宾A与水飞蓟宾B在血浆中浓度的线性范围为2. 0-50000ng · mL—1，最低定量限为2. Ong · mL—1，药物的日内、日间精密度在 9. 以内，相对误差小于士5. 7%。4.权利要求1的检测方法，其特征在于，所述预处理包括取血浆样品100μ L置于 1. 5mLEppendorf管中，依次加入乙腈100 μ L，内标溶液为200ng · mL—1柚皮苷溶液，乙腈配置，用量100 μ L，旋涡lmin，然后于12000r · mirT1离心8min，取上清液10 μ L进行LC-MS/ MS测定。5.权利要求1的检测方法，其特征在于，所述血浆来源于动物，是动物经过服用水飞蓟宾A和水...

【专利技术属性】
技术研发人员：褚扬，李伟，万梅绪，栗志文，郭嘉华，马晓慧，周水平，
申请(专利权)人：天津天士力制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：