一种鲟科鱼类卵子的筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种鲟科鱼类卵子的筛选方法。要解决现有的鱼类卵子质量的检测方法中缺少综合评价，导致评价方法存在偏差的问题。方法：一、从鲟科鱼类体内取出卵子；二、制备卵提取液；三、血清的制备；四、体液的制备；五、测定卵母细胞的极化指数；六、测定血清卵黄蛋白原浓度；七、测定Fe离子的含量、卵Zn离子的含量、卵VE的含量和卵谷草转氨酶的含量；八、测定ACP的含量和AKP的含量；九、测定的各项指标同时满足目标值，即表明同一卵巢内的其他卵子已达到成熟，即完成鲟科鱼类卵子的筛选。本发明专利技术方法使鲟鱼的受精率达85％以上，孵化率达到95％，鱼苗的成活率达到90％。用于鲟科鱼类的繁殖。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
鲟鱼(Acipenseriformes)是一群古老的生物，具有极高的研究价值和经济价值。 我国于上世纪九十年代初，开始鲟鱼养殖研究，规模发展迅速，至2008年，我国已成为世界最大的养鲟大国，年产量21. 396吨，占世界鲟鱼总量的83%。鲟鱼的卵子质量直接关系到胚胎发育以及仔稚鱼的成活和生长，与养殖效果紧密相关。此外，配子质量还可以反馈亲鱼培育状况、对指导苗种生产等也具有重要的意义。对鱼类卵子质量的评价通常是对其外部形态结构特征和生产性状能的检测，如色泽、受精率、死亡率等，对卵子、卵巢液和雌性血清的基础生化组成等方面研究相对较少。虽然，鲟科鱼类繁殖后期中的受精率、孵化率和成活率等生产性状是评价其配子质量最直接的指标，但这些指标涉及到后期养殖，不能在繁殖早期判断其卵子的质量，避免不必要的损失。目前，国内外还没有使用多种方法进行鲟科鱼类卵子筛选的方法，国外也只建立鲟科鱼类卵子质量单一的评价方法，不能全面地反映其卵子的特性。
技术实现思路
本专利技术是要解决现有的鱼类卵子质量的检测方法中缺少综合评价，导致评价方法存在偏差的问题，提供。本专利技术鲟科鱼类卵子的筛选方法，按以下步骤进行一、从鲟科鱼类体内取出卵子；二、制备卵提取液将步骤一取出的卵子剪碎，取鲜重5g，加入12 17mL浓度为0. 02 0. 05mol/L、pH为7. 2 8. 0的Tris-HCl缓冲液，在0 4°C研磨，得到的勻浆于12000 20000r/min的转速离心10 20min，取上清液，即为卵提取液；三、血清的制备将20 30mL新鲜的鲟科鱼类尾椎静脉血或尾椎动脉血室温放置20 40min后，于0 4°C低温保存20 25h，然后于2000 4000r/min离心20 30min，抽取血清，保存备用；四、体液的制备将步骤一取出的卵子经筛网过滤后，采集卵腔液15mL/尾，于液氮罐内保存五、测定卵母细胞的极化指数；六、测定鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度；七、根据卵提取液测定鲟科鱼类卵狗离子的含量、卵Si离子的含量、卵Ve的含量和卵谷草转氨酶的含量；八、根据体液测定鲟科鱼类体液ACP的含量和AKP的含量；九、选取同时满足从鲟科鱼类体内取出卵子中85%的卵子的卵母细胞的极化指数> 0. 07，鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度> 200 μ g/ mL，卵Fe离子的含量彡170 μ mol/L,卵Zn离子的含量彡145 μ mol/L,卵Ve的含量彡0. 12g/ mL，卵谷草转氨酶的含量彡1400U/L,体液ACP的含量彡85U/g和AKP的含量彡39U/g的鲟科鱼类的卵，即完成鲟科鱼类卵子的筛选。本专利技术的原理如下当血清卵黄蛋白原浓度彡200μ g/mL时，鲟科鱼类卵巢发育为IV期-V期，卵狗离子、离子、Ve和谷草转氨酶的含量与鲟科鱼类的受精率显著相关，体液ACP和AKP的含量与鲟科鱼类的受精率显著相关，卵母细胞胚泡接近动物极卵膜边缘，卵母细胞即成熟，因此其极化指数越低，卵母细胞越成熟。当检测的各项指标得到标准，即说明同一卵巢内的其他卵子已达到成熟，可用于体外受精。本专利技术的方法不仅可以定性鉴别鲟科鱼类的卵子质量，还可以定量的评价多种鲟科鱼类的繁殖性能，通过全面地评价鲟科鱼类的卵子质量，筛选出优质卵子。与单一的卵形态结构、生化组成等传统的鱼类卵子质量检测方法相比，本方法具有灵敏度高、方便快捷、 准确率高等优点，而且对受检鱼损伤小，是进行鲟鱼类卵子质量鉴别的理想方法。本专利技术的方法使得鲟鱼的受精卵质量大大提高，受精率达85%以上，孵化率达到95%，鱼苗的成活率达到90%。具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式鲟科鱼类卵子的筛选方法，按以下步骤进行一、 从鲟科鱼类体内取出卵子；二、制备卵提取液将步骤一取出的卵子剪碎，取鲜重5g，加入 12 17mL浓度为0. 02 0. 05mol/L、pH为7. 2 8. 0的Tris-HCl缓冲液，在0 4°C研磨， 得到的勻浆于12000 20000r/min的转速离心10 20min，取上清液，即为卵提取液；三、 血清的制备将20 30mL新鲜的鲟科鱼类尾椎静脉血或尾椎动脉血室温放置20 40min 后，于0 4°C低温保存20 25h，然后于2000 4000r/min离心20 30min，抽取血清， 保存备用；四、体液的制备将步骤一取出的卵子经筛网过滤后，采集卵腔液15mL/尾，于液氮罐内保存五、测定卵母细胞的极化指数；六、测定鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度；七、根据卵提取液测定鲟科鱼类卵狗离子的含量、卵Si离子的含量、卵Ve的含量和卵谷草转氨酶的含量；八、根据体液测定鲟科鱼类体液ACP的含量和AKP的含量；九、选取同时满足从鲟科鱼类体内取出卵子中85%的卵子的卵母细胞的极化指数> 0. 07，鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度彡200 μ g/mL,卵Fe离子的含量彡170 μ mol/L,卵Zn离子的含量彡145 μ mol/L, 卵Ve的含量彡0. 12g/mL,卵谷草转氨酶的含量彡1400U/L,体液ACP的含量彡85U/g和AKP 的含量> 39U/g的鲟科鱼类的卵，即完成鲟科鱼类卵子的筛选。 步骤八所述ACP为酸性磷酸酶，AKP为碱性磷酸酶。本实施方式的方法不仅可以定性鉴别鲟科鱼类的卵子质量，还可以定量的评价多种鲟科鱼类的繁殖性能，通过全面地评价鲟科鱼类的卵子质量，筛选出优质卵子。与单一的卵形态结构、生化组成等传统的鱼类卵子质量检测方法相比，本方法具有灵敏度高、方便快捷、准确率高等优点，而且对受检鱼损伤小，是进行鲟鱼类卵子质量鉴别的理想方法。本实施方式的方法使得鲟鱼的受精卵质量大大提高，受精率达85%以上，孵化率达到95%，鱼苗的成活率达到90%。具体实施方式二 本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中从鲟科鱼类体内取出卵子的方法为将鲟科鱼类用丁香油水溶液麻醉，然后于尾部腹面3 5骨板处， 使用取卵器沿腹壁肌肉直入体腔内部取出卵子；所述丁香油水溶液由丁香油和水按体积比 1 IO4组成。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤五中测定卵母细胞的极化指数的方法为取步骤一得到的卵子30粒，放入沸水内，煮沸2 4分钟后， 冷却至室温，然后沿卵极轴切开，测定胚泡到动物极卵膜的距离和胚泡到植物极卵膜的距离，按以下公式计算卵母细胞的极化指数，卵母细胞的极化指数=胚泡到动物极卵膜的距离/胚泡到植物极卵膜的距离。其它与具体实施方式一或二相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤六中测定鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度的方法为在96孔酶标板每孔中加入100 μ L的卵黄磷蛋白标准品，然后于4°C包被Mi ；弃去酶标板中的液体，每孔加入360 μ L封闭液，置于4°C封闭24h ；洗涤弃去封闭液，每孔加入300 μ L洗涤液，轻微震荡Imin后，弃去洗涤液，重复洗涤3次；每孔加入100 μ L步骤三制备的血清和100 μ L酶标抗体，室温孵育Ih后，弃去酶标抗体，用洗涤液洗涤4次；每孔加入100 μ L显色液，于室温暗处反应20分钟本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张颖，曲秋芝，孙大江，刘晓勇，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，
类型：发明
国别省市：