本发明专利技术公开了一种旋毛虫的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。用于对旋毛虫进行LAMP检测的专用引物，是根据如序列表中序列1所示的旋毛虫的特异性保守基因sb4重复序列设计的，用以定性检测待测样品中的旋毛虫。综上所述，本发明专利技术可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到旋毛虫，不需要复杂仪器，为旋毛虫的检测提供了新的技术平台，可用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测旋毛虫，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
中寄生虫的分子生物学检测方法，特别是涉及一种旋毛虫的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。
技术介绍
旋毛虫病是由旋毛形线虫[Trichinellaspiralis (Owen, 1835) Railliet, 1895] (简称旋毛虫)引起的食源性人兽共患寄生虫病，在全世界66个国家或地区均有分布。目前，国际公认的旋毛虫属分为8个种及3个基因型，即旋毛虫(Tl)、乡土旋毛虫(T2)、布氏旋毛虫(T3)、伪旋毛虫(T4)、米氏旋毛虫(T5)、纳氏旋毛虫(T7)、巴布亚旋毛虫(TlO)及津巴布韦旋毛虫(Tll)及T6、T8、T9。我国已发现存在有2种，即旋毛虫(Tl)和乡土旋毛虫 (Τ2)。目前，已知猪、野猪、狗、鼠等150多种动物可作为旋毛虫的宿主，由这些动物互相残食或摄取尸肉而传播。人患旋毛虫病主要因生食或半生食含有幼虫囊包的猪肉或其它动物肉类所致，急性期患者表现为发热、水肿、肌痛、腹泻等症状，感染后可终生带虫，表现为肌肉酸痛无力，重者可因严重的并发症死亡，死亡率为3% 30%。国际旋毛虫病委员会调查结果显示，自1995年1月至1997年7月已报道的旋毛虫感染人数达10，030人，估计全球至少有6，000万人感染该病。我国1964年至2005年已报道的病例达26，000余人，隐性感染人数达4000万人，由此产生巨大的医疗费用，仅急性感染者的治疗费用就高达数百亿元人民币，而隐性感染所造成的体质下降等各种间接损失则更为巨大。鉴于其暴发频率、感染人数及危害性，在欧盟2006年公布15种重要新发与再发性人兽共患病病种中，旋毛虫病作为唯一的食源性寄生虫病名列其中。旋毛虫不仅严重危害人类健康，也给养猪业和肉类工业造成巨大的经济损失。世界各国均把屠宰动物的旋毛虫检验作为首检和强制性必检项目，以此切断其由动物向人的传播，由于大量人力、物力及财力的耗费，致使旋毛虫病成为了目前世界范围内投入控制费用最高的寄生虫病。仅以2004年生猪屠宰的旋毛虫病检验费用为例，欧盟5. 7亿欧元/屠宰量为2亿头，美国10亿美元/屠宰量为3亿头，我国高达18亿元人民币/屠宰量为6. 18 亿头(3元人民币/头)。国际旋毛虫病委员会预测在未找到更为有效的检验方法以前，以上各国所公布的检验费用均不可能降低。目前，迫切需要对旋毛虫感染进行有效的诊断和控制，前者的有效性依赖于检测方法的可靠性，但至今仍未发现有效的检测方法。对于屠宰动物旋毛虫病的检验，国际兽疫局的法规检验方法为镜检法及集样消化法，目前我国也在延用这两种方法。然而，以上两种方法均存在一定的弊端，镜检法费时费力而且敏感性差，集样消化法虽可提高检出率，但仍十分繁琐。两种方法的敏感性均可造成肉类的漏检而引起人的感染，存在安全隐患。对于人旋毛虫病的诊断只能凭借病原学检查或血清学检查同询问病史相结合的方法。病原学检查取病人的肌肉压片镜检，查到旋毛虫幼虫囊包即可确诊，但是该方法对发病早期和轻度感染者的阳性率不高，而且不易被患者接受。血清学检查依靠从病人血清中查到旋毛虫特异抗体而确诊，该类方法比较简单、快速，但由于旋毛虫抗体在宿主体内出现的时间较晚， 故不能用于旋毛虫病的早期诊断，而且假阳性率较高。因此，寻找早期、简单、特异的旋毛虫检测方法是旋毛虫病研究领域的热点。环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由Τ· Notomi (Notomi Τ, Okayama H, MasubuchiH, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res2000;28(12) :63.)专利技术的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。 近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(Imai M, Ninomiya A, Minekawa H, et al. Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection bynewly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermalamplification method. J Virol Methods. 2007 ； 141 (2) :173-80.)禾Ij M LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人(Hayashi N, Arai R, Tada S, Taguchi H, Ogawa Y. Detection and identification of Brettanomyces/ Dekkera sp. yeasts with aloop—mediated isothermal amplification method. Food Microbiol. 2007 ；24(7-8) :778-85.)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了 LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。该技术还用于检测其它与人类相关的病毒，如巨细胞病毒、埃博拉病毒、慢性伯基特淋巴瘤病毒、虹彩病毒、人类疮疹病毒、造血组织坏死病毒、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒等。目前，LAMP技术在寄生虫方面的研究也有开展，如检测宿主体内的间日及恶性疟原虫、日本血吸虫、非洲锥虫、巴贝斯虫、黏液孢子虫、隐孢子虫、 弓形虫、猪带及牛带绦虫等。但是迄今为止，市场上还未见用于检测旋毛虫的LAMP专用引物与试剂盒问世。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种特异性和灵敏度较高的用于检测旋毛虫的LAMP检测专用引物。本专利技术所提供的用于对旋毛虫进行LAMP检测的专用引物，是根据如序列表中序列1所示的旋毛虫的特异性保守基因sb4重复序列设计的，用以定性检测待测样品中的旋毛虫。具体来讲，所述用于对旋毛虫进行LAMP检测的专用引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对引物1 (F3)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物2 (B3)， 其核苷酸序列如序列表中序列3所示；第二组引物对引物3 (FIP)，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4(BIP)，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；第三组引物对引物 5 (LF)，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6 (LB)，其核苷酸序列如序列表中序列7 所示。所述引物组合中各引物对(FIP和BIP) (LF和LB) (F3和B3)的摩尔比为 40 20 5。本专利技术的第二个目的是提供一种旋毛虫的LAMP检测方法。本专利技术所提供的旋毛虫的LAMP检测方法，可包括以下步骤1)以待测物的基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增；2)反应结束后进行结果判定在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在旋毛虫，橙色表示待测样品中不存在旋毛虫；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在旋毛虫，浊度无变化表示待测样品中不存在旋毛虫。在本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于对旋毛虫进行LAMP检测的专用引物，是根据如序列表中序列1所示的旋毛虫的特异性保守基因sb4重复序列设计的，用以定性检测待测样品中的旋毛虫。2.根据权利要求1所述的专用引物，其特征在于为以下三组引物对混合的引物组合， 第一组引物对引物1 (F3)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物2 (B3)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；第二组引物对引物3 (FIP)，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4 (BIP)，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；第三组引物对引物5(LF)，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6 (LB)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。3.根据权利要求2所述的专用引物，其特征在于所述引物组合中各引物对(FIP和 BIP) (LF 和 LB) (F3 和 B3)的摩尔比为 40 20 5。4.一种旋毛虫的LAMP检测方法，包括以下步骤1)以待测物的基因组DNA为模板，在权利要求1或2或3所述引物的引导下进行LAMP 扩增；待测物为肌肉、血液或粪便等；2)反应结束后进行结果判定在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在旋毛虫，橙色表示待测样品中不存在旋毛虫；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在旋毛虫，浊度无变化表示待测样品中不存在旋毛虫。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤1)中的；所述25μ1LAMP反应体系包括待测物的基因组 DNA 2 μ l,20mM Tris · HCl (pH 8....
【专利技术属性】
技术研发人员：黄留玉，袁静，李雪莲，刘威，邹大阳，王雪松，王中全，
申请(专利权)人：中国人民解放军疾病预防控制所，
类型：发明
国别省市：
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