甲基化FBP1基因的应用制造技术

发明专利技术涉及医药生物技术领域，具体提供甲基化FBP1基因在制备肿瘤诊断、检测和筛查药物中的应用。FBP1基因在肿瘤细胞以及肿瘤组织中特异性低表达，这是因为其启动子区DNA发生了肿瘤特异性的高甲基化；逆转该基因的DNA甲基化，可以恢复FBP1基因在肿瘤细胞中的表达。FBP1基因启动子在胃癌细胞和胃癌组织中高甲基化，FBP1基因甲基化也可以用来预测胃癌患者的预后：FBP1基因发生甲基化的胃癌患者预后较差，生存时间显著缩短。因此，FBP1基因启动子甲基化在肿瘤诊断、预防和治疗中有一定的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药生物
，具体是新抑癌基因FBPl基因DNA甲基化在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用。
技术介绍
胃癌是常见肿瘤之一。有报告显示，如果胃癌仅限于胃壁的粘膜层，5年的生存率可达95%。然而，目前很少有胃癌患者能够在早期被发现，导致5年生存率在20%左右。因此早检查、早治疗是降低胃癌死亡率的最关键手段。随着胃癌发病机理研究的深入，已发现多种基因异常。这些基因的改变决定着胃癌的生物学和临床行为，对这些改变的检测对于胃癌早期诊断具有重要意义，而使这些异常回复正常将是胃癌治疗的重要方向之一。基因的表观遗传学改变是肿瘤发生的重要原因，包括DNA甲基化的丢失、获得、以及组蛋白修饰为特征的染色质结构的变化等。这些表观遗传的改变，特别是抑癌基因启动子的超甲基化引起的基因沉默，影响着肿瘤发展的各个阶段。因此，抑癌基因启动子超甲基化水平可以作为肿瘤诊断和预后的分子标记，而抑制抑癌基因启动子甲基化或使已甲基化的抑癌基因启动子去甲基化将对肿瘤的预防、治疗具有重要意义。果糖-1，6-二磷酸作为糖酵解途径中重要的反应中间体受到果糖-6-磷酸酶和果糖-1，6- 二磷酸酶(Fructose-1，6-bisphosphatase，FBP)的双重调控。已有研究表明，肿瘤细胞中果糖-6-磷酸酶水平发生上调，但FBP基因仅以在肿瘤细胞中是否也发生变化以及其对肿瘤发生、发展的作用，至今还不清楚。在哺乳动物细胞中存在两种FBP基因的同工酶，其中FBP2基因只存在于肌肉中，而FBPl基因分布更为广泛。随着分子生物学的进展，越来越多的抑癌基因被发现和鉴定，不仅拓展了我们对肿瘤发生的认识，也为肿瘤诊治手段的开发提供了更多的机会。FBPl基因 (Fructose-1, 6-bisphosphatase-l) (Genbank No. NM_000507)，与肿瘤的关系尚不清楚，有待进一步研究。
技术实现思路
本专利技术旨在以FBPl基因的DNA甲基化为基础的检测手段，提供甲基化FBPl基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用。为实现专利技术目的，专利技术人提供如下技术方案甲基化FBPl基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用。本专利技术从实验得知，FBPl基因在肿瘤细胞以及肿瘤组织中特异性低表达，这是因为其启动子区DNA发生了肿瘤特异性的高甲基化。逆转该基因的DNA甲基化，可以恢复FBPl 基因在肿瘤细胞中的表达。专利技术人和其他研究者都发现在胃癌和胃增生组织中有很多肿瘤相关的基因因为启动子的超甲基化而产生转录静默，FBPl基因是专利技术人研究发现的其中一个新的基因，因FBPl基因启动子的超甲基化而在胃癌细胞系中低表达，而且在胃癌细胞系中表达外源 FBPl基因后可以显著抑制细胞的增殖，同时专利技术人也在胃癌和胃增生组织中也证实FBPl 基因启动子甲基化水平明显高于正常组织。以上实验都表明FBPl基因是一个抑癌基因，其启动子的甲基化水平可以作为胃癌早期诊断的生物标记物。作为优选，根据本专利技术所述的甲基化FBPl基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用，其中，所述的肿瘤诊断、检测或筛查方法中至少包括一对特异扩增FBPl基因甲基化的引物，所述的引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物(FBP1 MSP-F) 具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；下游引物(FBP1 MSP-R)具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。作为优选，根据本专利技术所述的甲基化FBPl基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用，其中，所述的肿瘤诊断、检测或筛查方法是以FBPl基因的DNA甲基化为基础的检测手段，所述的检测手段包括MSP法和BGS法。通过对FBPl基因mRNA的核酸序列分析，专利技术人发现在它的启动子区存在一个经典的CpG岛(CGI)(图2 )，序列分析的标准如下:GC含量>55%，0bsCpG/ExpCpG> 0. 65，长度大于500个碱基。因此我们采用甲基化特异性PCR (MSP)和亚硫酸盐处理后的基因组测序(BGS)来进一步验证FBPl基因启动子的甲基化。作为优选，根据本专利技术所述的甲基化FBPl基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用，其中，所述的肿瘤诊断、检测或筛查方法以FBPl基因甲基化分析为基础。作为优选，根据本专利技术所述的甲基化FBPl基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用，其中，所述的肿瘤包括但不限于胃癌肿瘤。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点本专利技术提供了一种甲基化的新抑癌基因在肿瘤诊断、检测和筛选中的应用，以甲基化 FBPl基因为基础的诊断方法可方便快捷的在分子水平上实现肿瘤的检测，同时，以甲基化 FBPl基因为靶点和核心的药物可望成为肿瘤靶向诊断、检测和筛选的一种新手段。附图说明图1是FBPl基因在去甲基化药物处理前后肿瘤细胞中的表达分析(RT-PCR法)。 FBPl基因在肿瘤细胞中的表达在去甲基化药物处理后显著升高。图2是FBPl基因启动子CpG岛示意图。FBPl基因含有一个典型的CpG岛，预示该基因可能受到DNA甲基化的调控。图3是MSP (甲基化特异PCR)方法检测胃癌细胞系中FBPl基因启动子DNA的甲基化情况。M表示甲基化；U表示非甲基化。图4是MSP (甲基化特异PCR)方法检测胃癌组织中FBPl基因启动子DNA的甲基化情况。M表示甲基化；U表示非甲基化。图5是BGS (亚硫酸氢盐修饰后测序)法检测胃癌细胞系中FBPl基因启动子DNA 的甲基化情况。黑圈代表甲基化；白圈代表非甲基化。图6是BGS (亚硫酸氢盐修饰后测序)法检测胃癌组织中FBPl基因启动子DNA的甲基化情况。黑圈代表100%甲基化；白圈代表100%非甲基化；灰圈代表甲基化和非甲基化各占一半。图7是肿瘤组织中FBPl基因的甲基化同肿瘤患者预后的关系。MSP法分析胃癌组织中FBPl基因启动子DNA的甲基化情况。生存率曲线法分析结果提示FBPl基因的DNA甲基化状况同肿瘤患者预后相关，FBPl基因发生甲基化的胃癌患者预后较差(p<0. 01)。具体实施例方式下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本专利技术的内容。应当理解，本专利技术的实施并不局限于下面的实施例，对本专利技术所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本专利技术保护范围。在本专利技术中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。本专利技术所述的新抑癌基因FBPl基因的DNA甲基化在开发肿瘤诊断、检测和筛选手段中的应用，可参考常规的药物配制方法和试剂开发。药物剂型和生物制剂为医学上认可的任何一种剂型，例如为粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规条件，例如Sambrook等作者的分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。试验试剂Trizol试剂，胎牛血清(FBS)，磷酸盐缓冲液(PBQ，RPMI-1640培养基，青霉素-链霉素(P/S)和0. 25%(W/V)胰蛋白酶/1 mM EDTA (Trypsin-EDTA)购于 Invitr本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金洪传，王娴，刘昕，王发亮，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：