本发明专利技术涉及一种用于恒温扩增快速检测副溶血性弧菌的引物及探针，其中正向引物序列为SEQ?ID?NO：1，反向引物序列为SEQ?ID?NO：2；P1探针的序列为SEQ?ID?NO：3；P2探针的序列为SEQ?ID?NO：4。同时本发明专利技术还提供一种包含上述引物探针序列的，用于恒温扩增快速检测副溶血性弧菌的试剂盒，以及应用方法。本发明专利技术的试剂盒根据待检菌株的保守基因序列设计引物和探针，从而保证检测方法的特异性。且具有与PCR检测方法相似灵敏度，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可。结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用通用型核酸扩增物快速检测板检测即可，简单、快速、安全、无污染，特别适用于食品检测机构。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于致病微生物检测
，具体涉及一种利用切刻内切酶恒温扩增 (NEMA)技术进行菌样的快速检测的方试剂盒及其应用。
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)是一种嗜盐性细菌主要存在于海产品中，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹或海蜇；以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，海水中可存活47天。如果不小心进食了含有该菌的食物，常会引起食物中毒，临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血性弧菌食物中毒病多在夏秋季发生于沿海地区，并经常是集体发病。近年来由于海鲜空运，内地城市病例也渐增多。因此，有效的检测出副溶血性弧菌对于食品安全是非常重要的。副溶血性弧菌现有的检测方法主要有常规分离鉴定法、普通PCR检测法、荧光定量PCR检测法、胶体金免疫层析试验法等。上述的方法或是存在耗时长、或是存在应用仪器昂贵，难以推展的问题，因此，需要开发出另一种能够有效的检测副溶血性弧菌的方法及其相应的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种副溶血性弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒及其检测方法，以克服现有技术的不足，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。本专利技术的主要原理如下(1)设计一对5'端带切刻内切酶识别序列的引物和一对分别由生物素和FITC标记的探针；(2)把引物和目标菌的模板DNA加入到模板预处理反应液，在Taq PlatinumDNA聚合酶作用下，通过几个预变性和扩增的循环过程，把切刻内切酶识别序列引入到待扩增序列中，作为NEMA恒温扩增的模板；(3)切刻内切酶识别NEMA模板上的识别序列，在其中一条核酸链上切割形成切口，暴露其3'端；(4)在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下，以暴露的3'端为起点，以未被切断的另一条核酸链为模板，合成新的双链核酸，旧链被剥离下来成为下一轮核酸合成的模板，同时在新合成的双链核酸上恢复切刻内切酶识别位点；(5)切割、延伸和剥离的步骤重复进行，扩增出大量靶核酸序列。(6)扩增产物利用通用型核酸扩增物快速检测板检测核酸扩增完成后，在反应管中加入探针与扩增产物杂交。把检测板水平放置在操作台上，取杂交产物 ο μ L加入检测板的样品孔中，再加入100 μ L缓冲液进行层析，IOmin左右判读结果。通用型核酸扩增物快速检测板的上C为质控区，T为检测区。检测板在质控区C和检测区T均出现红色条带，为阳性结果，表明样本中含有检测的目标物；仅在质控区C出现红色条带，为阴性结果，表明样本中没有检出目标物；质控区C和检测区T内均无红色条带出现，表明快速检测板失效。本专利技术的一个方面涉及用于恒温扩增快速检测副溶血性弧菌的引物及探针，其中正向引物序列为SEQ ID NO 1 5-GGCCATAATTCGAAGCTCTTCGCTACTTCACCATTGACGGCTAC-3 ；反向引物序列为SEQ ID NO 2 5-TTCGCCAAATCTAAGCTCTTCTCACAACGCTGACGGATAACG-3 ；其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；Pl探针的序列为SEQ ID NO 3 5-CACAACGCTGACGGATAACGTTTTGC-3，5 端标记生物素；P2探针的序列为SEQ ID NO 4 5-GCTCCACCAGTAGCCGTCAATGGTG-3, 3 端标记 FITC。本专利技术的另一个方面涉及一种副溶血性弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒，包括如下的组分(1)模板预处理反应液其中包括IOXTaq Platinum buffer II 反应缓冲液、0. 1 1. Ommol/L dNTP, 0. 1 1. Oymol/L 正向引物，0. 1 1. Oymol/L 反向引物，Taq Platinum DNA Polymerase 2. 5U ；所述的IOXiTaq Platinum buffer II 反应缓冲液成分为200mM Tris-HCl ρΗ8· 8，IOOmM KCl，IOOmM(NH4)2SO4, 20mM MgCl2 ；(2) NEMA恒温扩增反应液包括IOXNEBuffer 3 反应缓冲液，0. 1 1. Ommol/L dNTP, 5 % 30 % DMSO, 0. 1 1. Oymol/L正向引物，0. 1 1. Oymol/L反向引物和100 μ g/mL牛血清蛋白(BSA)；其中所述的10 X NEBuffer 3 反应缓冲液成分为IOOmmol/L NaCl，50mmol/ LTris-HCl, 10mmol/L MgCl2, lmmol/L dithiothreitol pH 7.9;(3) Nt. BspQI 切刻内切酶:4U/y L ；(4) Bst DNA 聚合酶2U/ μ L ；(5)5'端标记生物素探针Pl和3'端标记FITC的探针P2各lOymol/L(6)通用型核酸扩增物快速检测板。其中正向引物序列为SEQ ID NO :1，反向引物序列为SEQ ID NO 2 ；探针Pl的序列为SEQ ID NO :3，P2的序列为SEQ ID NO 4Pl 5-CACAACGCTGACGGATAACGTTTTGC-3 5 端标记生物素；P2 5-GCTCCACCAGTAGCCGTCAATGGTG-3 3 端标记 FITC。上述试剂盒应用于检测食品中的副溶血性弧菌，其使用方法，依次包括下列步骤 (1)-(4)(1)待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1. 6 2. 0范围内，浓度在 IOng/ μ L IOOng/ μ L 范围内；52)模板预处理将装有23 μ L模板预处理反应液的反应管加入2 μ L待检模板DNA，于94°C水浴 7min后迅速放入60°C的水浴中50s ；然后94°C水浴20s和60°C水浴50s过程反复进行5个以上循环；产物用于NEMA模板；(3) NEMA恒温扩增反应在装有46 μ L NEMA扩增反应液的反应管中加入2 μ L预处理过的模板DNA，LOyL Nt. BspQI切刻内切酶和1. 0 μ L Bst DNA聚合酶后，迅速放入57°C的水浴中60min，反应结束后取出；(4)产物检测反应结束后，反应管中加入探针Pl和P2各0. 5μ ，90τ水浴:3min自然冷却至恒温，用通用型核酸扩增物快速检测板检测产物。检测线T和质控线C均显示红色，说明待检样品为阳性。本专利技术的试剂盒根据待检菌株的保守基因序列设计5'端带切刻内切酶识别序列的引物，保证检测方法的特异性。本专利技术采用改进的切刻内切酶核酸恒温扩增(NEMA)技术，该技术特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用通用型核酸扩增物快速检测板检测即可，简单、快速、安全、无污染，特别适用于食品检测机构。具体实施例方式下面结合实例对本专利技术的方法做进一步说明，但实例仅限于说明，并不限于此，其中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的 《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜英辉，雷质文，王妍婷，王建广，房保海，尼秀媚，马维兴，张健，祝素珍，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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