一种降解百菌清的细菌菌株及制备方法技术

一种降解百菌清的细菌菌株及制备方法。本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体地说是一种降解百菌清的细菌菌株及制备方法本发明专利技术提供了一种用于降解百菌清的细菌RB-38TLysobacter?ruipuensis?sp.nov。将该降解百菌清的细菌在一定条件下进行培养，并用其制备液体菌剂或固体菌剂，用于降解土壤中残留的百菌清。利用该菌可以修复由于百菌清残留污染的土壤，可减少百菌清残留引起的土壤污染。本发明专利技术的微生物来自自然土壤，对环境无害，易于生产，通过产业化和商品化开发，可为农业可持续发展、环境保护、人类健康等提供基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物
，具体地说是。
技术介绍
有机农药是保证农作物高产丰收的重要农业生产资料，一直是化学工业发展的重点，农业上使用的主要有机农药品种过去一直以有机磷、有机氯等为主导，重要的有机氯农药如六六六、滴滴涕、百菌清等一直是农药主导产品。上个世纪80年代以前，我国农药一直是以有机氯农药占首位，约占农药总产量的60%左右(环境保护部，2008)。但部分有机氯杀虫(菌)剂性质稳定，难溶于水而易溶于脂，残效期长，被大量用于防治农林害虫，造成土壤、水域和空气污染。2001年5月，我国签署了《关于持久性污染的斯德哥尔摩公约》，部分有机氯农药品种，包括艾氏剂、氯丹、滴滴涕、狄氏剂、异狄氏剂、七氯、毒杀芬、六氯苯、灭蚁灵等有机氯农药已被列入急需采取行动解决的POPs (持久性有机污染物)品种(R-T&A, 2002)。2002年6月5日，我国农业部公布国家明令禁止使有机氯类农药包括六六六、DDT、 毒杀芬、艾氏剂和狄氏剂。我国除了艾氏剂、狄氏剂、异狄氏剂未生产之外，曾大量生产和使用过滴滴涕、氯丹、灭蚁灵、七氯、毒杀芬和六氯苯，作为公约的缔约国之一，我国已陆续停止了七氯和毒杀芬的生产和使用。中国对氯丹、六氯苯、灭蚁灵和滴滴涕四种PCPs物质申清了 5年的特定豁免，到2009年将逐步生产出替代产品。目前，在我国登记有效期内的有机氯类农药原药品种有百菌清、三氯杀螨醇、硫丹、四螨嗪、四氯苯酞、林丹和三氯杀虫酯。 其中，百菌清、三氯杀螨醇产量较大，约占有机氯类农药原药总产量的90%以上(环境保护部，2008)。百菌清化学名称2，4，5，6-四氯-I，3-苯二腈(2，4，5，6_tetrachloro-l， 3-benzenedicarbonitrile)，英文通用名Chlorothalonil (BSI，Ε-ISO, (M)F-ISO, SNSI)； Tetrachloroisophthalonethile(IUPAC) ；TPN(JMAP)。其他英文名称有 Bravo，Daconi 1, Dacotech，Colonil，Exotherm, Termil。其它中文别名有达科宁，大克灵，克劳优，霉必清， 打克尼尔，桑瓦特；四氯异苯腈。百菌清是一种广谱，非内吸型的有机氯杀菌剂，是目前在我国用量最大的有机氯农药，年产量超过8000吨(新农药，200 ，广泛用于防治各种蔬菜、瓜果、花生、水稻、小麦等作物真菌病害；在美国，百菌清是第二大类广泛使用的农业杀菌剂，每年使用量达5000 吨(CoxC，1997)。然而它在鸟类、鱼类及其水生脊椎动物中都有很高的蓄积毒性，百菌清对大鼠肾脏有致癌作用，在环境中较稳定，残效期长，具明显的蓄积毒性。而且百菌清还是环境激素类似物，会对人和动物内分泌系统产生干扰作用。其在土壤中的长期积累以及短期内无法替代造成了农田土壤的污染。值得一提的是，百菌清在自然界中的主要代谢物质之一的4-羟基_2，4，5-三氯间苯二甲腈，毒性是母体的三十倍，并且移动性和持久性也远远大于母体，其毒性正引起人们的重视(Rosanoff K A&Siegel M R，1981)。百菌清的代谢转化主要有百菌清的水解、在土壤中的生物降解、光化学降解、臭氧降解。其中土壤生物降解是百菌清代谢转化的主要途径。参与降解的土壤微生物主要包括真菌、细菌、放线菌等，其中细菌由于生化上的多种适应能力和容易诱发突变菌株等特性， 在降解农药的微生物种群中占有重要位置。土壤中广泛存在着可降解百菌清的细菌。氮单胞菌(Azomonas)、黄杆菌(Flavobacterium)、莫拉氏菌(Moraxella)、假单胞菌(Paeudomonas)、微球菌 (Micrococcus)等都作为百菌清的降解菌被分离到(Sato&Tanka 1987，katayama等 1991a)。但这些细菌大多数都不能将百菌清作为唯一的碳源，而需要添加其他的碳源 (Katayama et al，1991a)。Motonaga等(1995)从百菌清作用过的土壤中分离到一株革兰氏阴性棒状菌株TBI，在培养120h后，将75%的百菌清转化为TPN-OH和Cl—。该菌株同样也不能在含有百菌清的无机盐培养基中生长。因此，本专利技术的目的是提供一种能利用百菌清作为唯一的碳源，用于降解百菌清的细菌菌株及其制备方法。本专利技术涉及一种可降解百菌清的细菌菌株及其制备方法。
技术实现思路
百菌清的微生物降解，就是利用微生物来减少百菌清在土壤中的残留。本专利技术的目的是针对目前还没有更好的用于降解土壤残留百菌清的微生物极其制剂，而提供一种从土壤中分离筛选培养出的特定的百菌清降解细菌，用于修复百菌清残留污染的土壤，本专利技术还提供了该降解细菌的制备方法。为有效地分离到降解百菌清的细菌菌株，本专利技术通过采集河南安阳部分农药厂周边百菌清长期污染的土壤，用平板稀释的方法，在含有百菌清的平板上分离得到1株百菌清降解细菌1 -38\经16S rDNA系统发育分析将所有菌株鉴定到属，并经过进一步的 G+C m0l%含量的测定、DNA-DNA杂交、化学鉴定及生理生化特征的鉴定，将该菌株坚定为 Lysobacter ruipuensis sp. nov，该菌种已在中国专利局指定的微生物保藏单位，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏登记号为=CGMCC 1. 10344τ,同时也在德国菌保中心DSMZ保藏，其保藏登记号为DSM 23235τ。RB_38T Lysobacter ruipuensis sp. nov 具有下述性质培养特征在LB平板培养基上(蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g, H2O lOOOmL，琼脂20g，用 lmol/L HCl或NaOH调节pH值至7. 0)，菌落圆形，淡黄至砖红色，菌落边缘平整，有光泽。镜检形态菌体长杆状，经革兰氏染色，为革兰氏阴性。上述百菌清降解细菌按以下方法分离、纯化和保存(1).基础无机盐培养基NH4NO3 1. Og, MgSO4 · 7H20 0. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, KH2PO4O. 5g, NaCl 0. 5g, K2HPO4L 5g, H2O lOOOmL，用 lmol/L HCl 或 NaOH 调节 pH 值至 7· O。O). LB 培养基蛋白胨10g，酵母粉 5g，NaCl IOg5H2O lOOOmL，琼脂 20g，用 lmol/L HCl 或 NaOH调节pH值至7.0。(3).分离筛选培养基在相应的固体培养基中加入不同浓度的百菌清母液，使其终浓度为5、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、60、80、100mg/L，混勻后倒平板。(4).菌株的选择性分离用天平称取IOg 土样，置于90mL无菌水中，30°C，180rpm，20min,打散土壤颗粒，制均勻土壤悬液，室温静置30min，取上清作为土壤原液(10°)，再用ImL无菌吸管吸取ImL上清液加入9mL无菌水中，充分摇勻后制得KT1稀释液，依次稀释得到10_2，10_3稀释液。分别吸取10_3、10_4、10_5稀释液200ul涂布到含有百菌清的固体选择平板上，每个稀释度3个平行，置于30°C培养箱培养，每天观察结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：缪作清，陈三凤，任晓洁，李世东，郭荣君，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：