本发明专利技术涉及水稻胡麻叶斑病原菌的一种分子鉴定方法。所说的分子鉴定包括扩增到的ITS区、18S?rDNA核苷酸序列，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1及SEQID?NO.2所示。分子鉴定时，先提取待测菌的DNA，用文中胡麻叶斑病原菌的18S?rDNA和ITS引物通过聚合酶链式反应扩增挑取到的DNA。如果有扩增产物，测定扩增产物的核苷酸序列，交其与SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2分别进行比较。在上述分析基础上，判断待测病原菌是否是胡麻叶斑病原菌。用本发明专利技术的方法可以为胡麻叶斑病的有效诊断和防治提供可靠依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，具体地说，是将胡麻叶斑病原菌从染病的水稻材料上分离和培养后提取DNA，利用分子生物学的方法进行鉴定，属于病原真菌鉴定
技术介绍
水稻胡麻叶斑病是由半知菌的平脐蠕孢属引起的一种真菌病害。从秧苗期到收获期都可发病，稻株上各部位均易受害。叶片及叶鞘上的病斑多为芝麻粒状，病斑中央为褐色至灰白色，边缘褐色，周围有深浅不同的黄色晕圈，严重时能相互结成不规则的大病斑。谷粒感病受害，病斑呈灰黑色，可扩大及全粒，造成秕谷，严重的谷粒质脆易碎，俗称“茶米”。 该病分布于世界各稻区，我国南北稻区均有发生。感病田块，一般减产10-30%，严重者减产 50%以上甚至绝收。孟加拉国曾因本病流行，稻谷失收而造成饥荒。通常认为该病是由于缺乏肥、水等原因引起的。在我国，此病以前发生普遍而严重，成为国内水稻三大病害之一。 后来随着水稻生产管理和施肥水平的不断提高，其为害日益减轻。因此，近年来对该病很少有研究，研究资料比较缺乏。由于耕作方法和气候的改变，该病在我国南北多个稻区近几年又严重发生。因此，必需重新重视对胡麻叶斑病的研究。但目前还缺乏水稻胡麻叶斑病原菌的分离和鉴定方法，无法有效地开展对水稻胡麻叶斑病的研究。同时，由于胡麻叶斑病和稻瘟病在病症上非常相像，从发病形态上容易混淆这两种病害，严重影响了该病害的防控。真核生物的核糖体包括大亚基60S与小亚基40S，大亚基60S由25_28SrRNA、5. 8S rRNA和5S rRNA及核糖体蛋白构成；小亚基40S则由18S rRNA与相关核糖体蛋白构成。 5.8S、25S、18S之间的内转录基因间隔序列为基因内转录间隔序列(ITS)。因此，18S rDNA 是真核生物核糖体小亚基40S rRNA基因群的一个转录原件，它既有保守区又有可变区，应用分类范围为界、门、纲、目、科、属、种间，是系统发育中，种级以上的良好标记，一般适应于较高水平类群间的系统分析。ITS应用分类范围为属、种间、种内，广泛适应于较低分类阶元。不同的真菌，其18S rDNA和ITS序列和长度都是不同的，如果能对胡麻叶斑病原菌的 18S rDNA和ITS进行聚合酶链式扩增并测序，就可以通过比较待测真菌与胡麻叶斑病原菌 18S rDNA和ITS长度和序列来判断待测真菌是否属于胡麻叶斑病原菌。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决胡麻叶斑病原菌的鉴定问题，提供一种用分子生物学技术鉴定胡麻叶斑病原菌的方法。为达到本专利技术的目的，本专利技术人多次从发病田块取样感染胡麻叶斑病的水稻叶片，样品均经过植物病理学专家鉴定确认。采用本专利技术的方法，从病原菌中提取DNA，用设计的18S rDNA和ITS引物通过聚合酶链式反应扩增提取到的DNA模板，扩增产物电泳结果显示，18S rDNA区序列长度为1^9bp，ITS区序列长度为586bp，如图1所示，具体序列见 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2。上述鉴定方法中，待鉴定真菌的基因组DNA提取采用氯化苄提取纯化的方法，其步骤为取真菌材料加入无菌研钵中，同时加入用PH9. 0的0. 15mol/L三羟氨基甲烷溶液 7ml与pH8. 0的0. 05mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液8mL混合后定容至IOOmL配制而成的提取缓冲液，迅速彻底研磨混勻，取研磨后的液体加入无菌离心管中，再依次加入质量百分比浓度为10%的十二烷基磺酸钠溶液和氯化苄试剂，混勻，50°C水浴处理，加入等体积的pH5. 2 的3mol/L醋酸钠溶液混勻，加入70-75%的乙醇洗涤沉淀，离心弃去乙醇，挥发干乙醇后用无菌水溶解，琼脂糖凝胶电泳分析得到基因组DNA样品。上述扩增18S rDNA和ITS片段的聚合酶链式反应条件是。扩增体系单核苷酸加 1μ 1 ；缓冲液加6. 25 μ 1 ；引物加10 μ 1 ；模板基因组DNA加1.5μ 1 ；聚合酶加2. 5μ 1 ；加双蒸水补足至50 μ 1。扩增条件95°C变性5分钟；94°C 40秒，45°C 40秒，72°C 90秒，33个循环；最后72°C延伸5分钟。4°C终止反应并保存。本专利技术与现有技术相比，有如下有益效果通过测定胡麻叶斑病原菌的18S rDNA和ITS序列，建立了一套利用分子生物学手段鉴别胡麻叶斑病原菌的方法。专利技术人从胡麻叶斑病原菌中提取DNA，用设计的18S rDNA 和ITS引物经聚合酶链式反应扩增提取到的DNA模板，扩增产物经过测序，胡麻叶斑病原菌 18S rDNA区序列长度为1829bp, ITS区序列长度为586bp，具体序列见SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2。利用本专利技术的鉴定方法，通过直接测定待测菌的18S rDNA和ITS区序列，准确判断水稻生产上发生的疑似病害是否是胡麻叶斑病，从而采取及时有效的防控措施。附图说明图1是水稻胡麻叶斑病原菌分子特征。其中18S rDNA扩增片段长度约为1800bp， ITS区序列长度约为580bp。具体实施例方式1.菌株的分离取有胡麻叶斑病典型症状的大田水稻叶片，在病健交界处剪取小块发病组织，用 75%的乙醇浸泡30秒、0. 升汞浸泡2分钟、无菌水换洗5次，将带病组织放在培养皿内的无菌湿润滤纸上，用封口膜封好，25°C光照培养2天，挑取组织样品边缘的单个菌丝，转移到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)固体培养基上培养。为保证分离到的菌的纯度，连续多次重复挑取每次分离培养的菌丝。2.分子鉴定(1)真菌DNA的提取挑取菌丝，接到PDA上活化2_3天，然后将菌饼接到PDA液体培养基中，28°C、120转/min摇床摇动黑暗培养2天，漏斗过滤培养物得到菌丝体。菌丝体用液氮研磨后，改良CTAB法提取菌株DNA。(2)以上述提取的基因组DNA为模板，分别采用如下的扩增体系和扩增程序扩增18SrDNA和ITS核酸片段。18SrDNA引物P1 (5' -GTA GTC ATA TGC TTG TCTC-3‘ ) ；P2(5' -TCC GCA GGT TCA CCT ACGGA-3‘ ) ；ITS 引物 P3(5' -TCC GTA GGT GAA CCT GCGC-3‘ ) ；P4(5' -TCC TCC GCT TAT TGA TATGC-3‘)。 扩增体系单核苷酸加1μ 1 ；缓冲液加6. 25 μ 1 ；引物Ρ1/Ρ2或者引物Ρ3/Ρ4加10 μ 1 ；模板基因组DNA1. 5 μ 1 ；聚合酶加2. 5 μ 1 ；加双蒸水补足至50 μ 1。扩增条件95°C变性5分钟后；94°C 40秒，45°C 40秒，72°C 90秒，进行33个循环；最后72°C延伸5分钟，4 °C保存。 (3)PCR产物电泳，用胶回收试剂盒纯化回收目的片段。目的片段的克隆将回收的目的片段连接至PMDTM18-T载体，然后转染至JM109感受态细胞中，将转染的JM109感受态细胞涂布在含有X-Gal、IPTG、Amp的琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。在37°C培养至少17 小时，置于4°C冰箱内2小时。( 质粒提取和测序挑取白色菌落，接入LB液体培养基培养，用质粒提取试剂盒提取质粒，送交生物公司测序。3.用该方法验证某种待测真菌是否为胡麻叶斑病原菌(1)提取待鉴定真菌的DNA，具体如下无菌收集培养待鉴定菌种的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭士伟，陈洪亮，彭陈，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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