本发明专利技术是一种西瓜细菌性果斑病菌的基因检测试剂盒，属于植物病原菌的检测领域，专一针对西瓜细菌性果斑病菌（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘａｖｅｎａｅｓｕｂｓｐ．ｃｉｔｒｕｌｌｉ，Ａａｃ）的检测。一种西瓜细菌性果斑病菌免疫ＰＣＲ检测试剂盒，其主要特点是包括有：８－１０×ＰＣＲ缓冲液；氯化镁２０－２５ｍｍｏｌ／Ｌ；ｄＮＴＰ ８－１０ｍｍｏｌ／Ｌ；Ｔａｑ酶１－５ＩＵ／μＬ；引物５’－ＧＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣ－３’８－１０ｐｍｏｌ／μＬ；引物５’－ＣＴＧＣＣＧＴＡＣＴＣＣＡＧＣＧＡＴ－３’８－１０ｐｍｏｌ／μＬ；双蒸水９９％～１００％；包被了Ａａｃ单克隆抗体的检测ＰＣＲ管３个；包被了Ａａｃ单克隆抗体的阳性对照ＰＣＲ管３个；包被了Ａａｃ单克隆抗体的阴性对照ＰＣＲ管３个；阳性对照１管；阴性对照１管。本发明专利技术的优点是能快速、简便、准确的检测病原菌的试剂盒，在１０小时内就可以完成检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是一种西瓜细菌性果斑病菌的基因检测试剂盒，属于植物病原菌 的才企测4贞i或，专——4十只十西瓜纟田菌'〖生果扭王病菌(Acidovorax avenae subsp. citrulli, Aac)的;f金测。适用于西瓜细菌性果斑病菌的田间预防及 进出口植物一企疫中Aac快速4企测。
技术介绍
西瓜细菌性果斑病又称细菌斑点病、西瓜水浸病、果实腐斑病等，是西 瓜、籽瓜风险最高的一种种子传播病害。苗期和成抹均可发病。瓜苗染病沿 中脉出现不规则褐色病变，有的扩展到叶缘，从叶背面看呈水渍状，有时被 一个黄色组织带包围。种子带菌的瓜苗在发病后l-3周即死亡。西瓜果实染 病，初期在果实上部表面现数个几毫米大小灰绿色至暗绿色水渍状斑点，后 迅速扩展成大型不规则的水浸状斑，3~5天内便布满除接触地面部分的整 个果面。早期形成的病斑老化后表皮龟裂，常溢出黏稠、透明的琥珀色菌脓， 果实很快腐烂。该病多始于成瓜向阳面，与地面接触处未见发病，瓜蔓不萎 蔫，西瓜细菌性果斑病的病原菌为燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp. citrulli, A. a. c )。该菌属原核生物界(Procaryotae )、薄壁菌门(Gracilicutes )、 暗细菌纲 (Scotobacteria )、 假单孢菌科(Pseudomonadaceae )、嗜酸菌属(Acidovorax )。由于该病主要通过种子带菌进行远距离传播，且病瓜种子带菌率较高， 所以对种子进行严格检测是防止该病害传播的最重要手段。目前国内对西瓜果斑病菌检测采用的方法主要有育苗检测、分离培养片企测、免疫血清学和PCR检测等方法。育苗检测、分离检测所需检测时间较长，无法满足多批次 种子进出口检测要求；免疫血清学如ELISA检测灵敏度相对较低，有时甚至 出现假阴性现象。而只有少量种子携带病原这一实际情况，更使得以上检测 方法的灵敏度和检出率受到限制，发展一种将病原富集和基因水平检测有效 结合的方法，是进出口种子西瓜细菌性果斑病菌检测急需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于避免现有技术的不足提供一种西瓜细菌性果斑病菌 免疫PCR检测试剂盒。以克服现有的植物病原菌检测方法灵敏性低、特异性 差、费时不稳定的不足，将病原富集和基因水平检测有效结合的方法，用免 疫学方法先将样品中的病原富集，然后进行PCR扩增，可以极大的提高检测 灵敏度，同时大大提高了种子检测的效率。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为 一种西瓜细菌性果斑病菌 免疫PCR检测试剂盒，其主要特点是包括有8-10 x PCR緩冲液；氯化镁20-25 國1/L; dNTP 8-10 mmol/L; Taq酶1-5 IU/uL;引物 5， -GACCAGCCACACTGGGAC-3， 8-10 pmol/uL;引物5， -CTGCCGTACTCCAGCGAT-3， 8-10pmol/uL;双蒸水99%~100%;包被了 Aac单克隆抗体检测PCR管3个；包被了 Aac单克隆抗体阳性对照PCR管3 个；包被了 Aac单克隆抗体阴性对照PCR管3个；阳性对照1管；阴性对照i管；使用该试剂盒对参试细菌进行免疫PCR扩增，西瓜细菌性果斑病菌产生 分子量为360bp的特异性扩增产物。其扩增条件是PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌，释放 DNA作为扩增模板；PCR扩增条件94。C变性20秒，35。C退火20秒，72°C6延伸35秒，35次循环完成后72。C延伸7分钟，最后4。C保持。一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法，所述使用方 法的步骤为(1 )加样品孵育2小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的Aac;(2 ) PCR扩增，PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌，释放DNA作为扩增模板；(3 ) 1-1. 5°/。琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析； (4 )对条带进行分析得出结论；若有360bp扩增条带，则判断为西瓜细菌性果斑病菌。 进一步，所述的西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法， 所述的PCR管包被Aac单克隆抗体的具体步骤为(a) 用包被緩冲液按照1: 100-300稀释Aac单克隆抗体，抗体浓度为 0. 4-0. 8mg/ml，将稀释好的抗体按照每管50 u L加入PCR管室温4小时或4 'C过夜包^^抗体。(b) 包被緩冲液配方为碳酸钠1.59g,碳酸氢钠2.93g,叠氮化钠0. 2 g，溶于1000ml PBST緩沖液中，调pH值到9. 6。配制PBST:氯化钠8. 0 g, 无水磷酸氢二钠1. 15 g，无水磷酸二氢钾0. 2 g，氯化钾0. 2 g，吐温-20 0. 5 毫升，加双蒸水到1000ml，调pH值到7. 4。进一步，所述的西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法， 所述的加样品將育2小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的Aac的具体步 骤为a) 样品制备方法为按照每两克种子加入2tnl提取緩沖液的比例，研 磨种子至种皮破裂，静置1小时后，用纱布过滤取上清，5000rpm(转/每分 钟)离心5分钟，用100 u L重悬沉淀直接作模板进行PCR扩增；b) 抽提緩沖液配方为:Na2SO30. 13g/ml,聚乙烯吡咯烷酮(PVP ) 2g/ml叠氮化纳0. 02g/ml，鸡蛋清蛋白与吐温-20 ( tween-20)各0. 5ml/L， pH为 7.4,抽提緩冲液使用量根据需要配置， 一般种子和緩沖液的重量比约为1: 2-10。c)加样品50uL,在室温或37。C的条件下在緩冲液中孵育2小时，抗体 会特异性捕捉和富集样品中的Aac;一种西瓜细菌性果斑病菌基因组DNA提取方法，步骤为A. 取l. 5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm(转/每分钟)离心1 分钟，丟去上清夜，收集菌体。B. 加入400ul裂解液(40mM三轻甲基氨基曱烷-醋酸(Tris-醋酸)，20mM 醋酸钠，lmM乙二胺四乙酸(EDTA ) ， 1%十二烷基石黄酸钠(SDS ) , pH7. 8，混匀， 置于37'C水浴1小时。C. 然后加入20Oul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm(转/每分钟) 离心15分钟。D. 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E. 加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8. 0)， -20度保存1 小时后，13000rpm(转/每分钟)离心15分钟，弃上清液，沉淀用70°/。乙醇洗 2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4。C保存备用。西瓜纟田菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp. ci trul 1 i ， Aac )免 疫PCR检测试剂盒，属于农作物病害防治和植物检疫范畴，基因位于16S rDNA。使用本专利技术试剂盒对8个参试菌林进行检测，Acc得到360bp特异性 目标条带，其余菌抹无产物；对26个ELISA检测阳性样品进行验证，符合 率为98°/。，且不符合样品均为ELISA未有效检测样品。该试剂盒集病原浓缩、 特异性抗体识别、PCR扩增为一体，是一种灵敏度极高、检测速度快、结果 准确、使用方便的试剂盒，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种西瓜细菌性果斑病菌免疫ＰＣＲ检测试剂盒，其特征是包括有：８－１０×ＰＣＲ缓冲液；氯化镁２０－２５ｍｍｏｌ／Ｌ；ｄＮＴＰ ８－１０ｍｍｏｌ／Ｌ；Ｔａｑ酶１－５ＩＵ／μＬ；引物５’－ＧＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣ－３’８－１０ｐｍｏｌ／μＬ；引物５’－ＣＴＧＣＣＧＴＡＣＴＣＣＡＧＣＧＡＴ－３’８－１０ｐｍｏｌ／μＬ；双蒸水９９％～１００％；包被了Ａａｃ单克隆抗体的检测ＰＣＲ管３个；包被了Ａａｃ单克隆抗体的阳性对照ＰＣＲ管３个；包被了Ａａｃ单克隆抗体的阴性对照ＰＣＲ管３个；阳性对照１管；阴性对照１管； 使用该试剂盒对参试细菌进行免疫ＰＣＲ扩增，西瓜细菌性果斑病菌产生分子量为３６０ｂｐ的特异性扩增产物； 其扩增条件是：ＰＣＲ循环增加２０分钟，９４摄氏度高温裂解细菌，释放ＤＮＡ作为扩增模板；ＰＣＲ扩 增条件：９４℃变性２０秒，３５℃退火２０秒，７２℃延伸３５秒，３５次循环完成后７２℃延伸７分钟，最后４℃保持。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘箐，
申请(专利权)人：兰州慧盟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]
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