本发明专利技术属于植物基因工程领域，提供一种水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的克隆方法。该方法先获取拟南芥根特异性基因EXP18，再获取水稻根特异性表达基因EXP18D启动子。因为本发明专利技术克隆到水稻根特异性表达基因EXP18D启动子，而该启动子为植物根系特异性表达的启动子，可以驱动相关功能基因的表达，所以该启动子具有特定地改变植物的根部形态、获得相应的抗旱植株潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程领域，特别涉及一种水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的克隆方法。
技术介绍
启动子是基因表达调控因子中最重要的因子，基本决定一个基因是否表达、何时表达和何处表达。按作用方式和功能，启动子大体可以分为组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子三大类。目前，组织特异性启动子的调控机制己进入深入研究阶段，该类启动子除具有基本结构外，通常还有一些调控特异表达的序列，这些序列为转录因子提供了结合位点，通过与蛋白质的相互作用来调节基因表达。在组织特异性启动子的驱动下，基因的表达通常只发生在特定的组织或器官，并往往表现出发育调节的特性。根是植物吸收水分和营养物质的重要器官，根特异表达系统可用于研究植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等。拟南芥的磷酸转移酶基因启动子与Gtt？融合， 在农杆菌介导下转化拟南芥和水稻，组织化学分析显示蛋白只在拟南芥和水稻的根毛及根表皮表达，说明该启动子是根特异的。Borisjuk等用根特异启动子mas2、GFP和烟草钙网蛋白基因(calreticulin)构建融合表达载体，转基因烟草水培研究结果表明，根细胞不仅能高效产生某些目的蛋白质，而且可将目的蛋白质分泌到液体培养基中。植物的根系在植物抗旱中起着重要的作用，根系吸水力的提升和根系形态的建成，无疑对提高植物的吸水力，增强其抗旱性具有重要的意义。多数的植物功能基因如激素合成、代谢相关基因，植物生长、发育调控基因在植物的地上部分和地下部分均有表达，通过简单的转基因或者基因沉默的方式只能从整体上调节基因在植物体的表达，不能特异性的实现对植物根系功能和发育的调控。为了解决上述问题，需要利用植物根系特异性表达的启动子驱动相关功能基因的表达，以达到既能提高植物吸水性、增加植物根系长度和数量，又不影响植物地上部生长、 不损害植物营养生长的目的，由此通过转基因的手段能够获得相应的抗旱植株。目前的研究中需要克隆得到根特异性表达基因启动子。
技术实现思路
本专利技术提供一种水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的克隆方法。该方法包括以下步骤I、获取拟南芥根特异性基因EXP18 A、分别从拟南芥植株中提取拟南芥根总RNA和拟南芥叶总RNA，再分别进行反转录PCR 反应，分别扩增得到拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列；B、分别以所述的拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列为模板，分别根据拟南芥根特异性基因设计引物，再分别进行半定量PCR反应，筛选得到拟南芥根特异性基因EXP18 ；II、获取水稻根特异性表达基因EXP18D启动子A、将所述的拟南芥根特异性基因EXP18的序列进行在线分析比对，得到水稻根特异性基因；B、分别从水稻植株中提取水稻根总RNA和水稻叶总RNA，再分别进行反转录PCR反应， 分别扩增得到水稻根cNDA序列和水稻叶cNDA序列；C、分别以所述的水稻根cNDA序列和水稻叶cNDA序列为模板，分别以所述的水稻根特异性基因设计引物，进行半定量PCR反应，筛选得到水稻根特异性表达基因EXP18D ；D、在线分析得到水稻根特异性表达基因EXP18D的启动子的序列信息，再在水稻根基因组DNA中进行克隆得到所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子。步骤I -B中所述的拟南芥根特异性基因在拟南芥信息资源网站的编号分别为 AT1G79580. 1、AT1G62980. 1、AT1G66470. 1、AT1G27740. 1、AT1G54970. 1、AT3G10710. 1、 AT1G12560. UAT2G26420. UAT1G12040. UAT1G62440. UAT3G62680. UAT2G26290. 1。步骤II -A中所述的水稻根特异性基因在日本水稻基因组数据库(RGP)的编号分别为:os03g0377100、os01g0249100、os01g0248900、os03g0156000、os01g0274500。所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的序列为SEQ ID No :1。在步骤II之后，进行所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子功能验证，包括以下步骤A、在线分析得到将所述的稻根特异性表达基因EXP18D启动子的转录起始位点、含有的顺势作用元件；B.将所述的稻根特异性表达基因EXP18D启动子进行5’端缺失处理，经过PCR反应得到EXP18D启动子缺失体片段；C.将所述的EXP18D启动子缺失体片段分别构建EXP18D启动子缺失体GUS表达载体；D、将所述的EXP18D启动子缺失体GUS表达载体转化拟南芥植株，得到转化体植株，再进行检测。所述的EXP18D启动子缺失体片段的大小分别为1957 bp、1720 bp、1066 bp,954 bp、776 bp、432 bp。本专利技术的有益效果为因为本专利技术克隆到水稻根特异性表达基因EXP18D启动子，该启动子为植物根系特异性表达的启动子，可以驱动相关功能基因的表达，所以该启动子具有特定地改变植物的根部形态、获得相应的抗旱植株潜力转入该启动子的植株，在同等干旱条件下，存活率比相比对照组的野生型植株高60-70%。附图说明图1 实施例1中，12个拟南芥根特异性基因的扩增产物电泳结果。图2 实施例1中，5个水稻根特异性基因的比对结果。图3 实施例1中，5个水稻根特异性基因的同源树分析结果。图4:实施例1中，5个水稻根特异性基因的扩增产物电泳结果。图5 实施例1中，水稻基因EXP18-D的基因图谱； 图6 实施例1中，水稻基因启动子EXP18-D的基因图谱；图7 实施例1中，水稻根特异性表达基EXP18D启动子序列中含有的顺式作用元件的分析结果；图8 实施例1中，6种EXP18D启动子缺失体的结构简图。图9 实施例1中，6种EXP18D启动子缺失体⑶S表达载体的结构简图。图10 实施例1中，6种EXP18D启动子缺失体⑶S表达载体在拟南芥转化体植株的表达量的Gus染色图。具体实施例方式实施例1 一种水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的克隆方法，该方法包括以下步骤 I、获取拟南芥根特异性基因A、分别从拟南芥植株中提取拟南芥根总RNA和拟南芥叶总RNA，再分别进行反转录PCR 反应，分别扩增得到拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列； 具体的操作为分别取生长20d的拟南芥植株的根与叶为材料，用Trizol法分别提取拟南芥根与叶的总RNA，分别进行反转录PCR反应，分别得到拟南芥根cDNA和拟南芥叶cDNA ； 所述的反转录PCR反应的体系为RNA :1. 2 μ g, Oligo (dT) 15 2 μ 1， M-MLV buffer :5μ 1, dNTP Mix :1. 25 μ 1，M—MLV :1 μ 1，RNase inhibitor :0. 6 μ 1， DEPC处理后的ddH20 补足25 μ 1 ； 所述的反转录PCR反应的程序为加入上述oligo (dT) 15后70°C反应5分钟，然后加入反转录PCR上述体系中的其他试剂，37°C反应1小时，得到所述的拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列。B、分别以所述的拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列为模板，分别根据12 个拟南芥根特异性基因设计引物，再进行半本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种水稻根特异性表达基因ＥＸＰ１８Ｄ启动子的克隆方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：Ⅰ、获取拟南芥根特异性基因ＥＸＰ１８：Ａ、分别从拟南芥植株中提取拟南芥根总ＲＮＡ和拟南芥叶总ＲＮＡ，再分别进行反转录ＰＣＲ反应，分别扩增得到拟南芥根ｃＮＤＡ序列和拟南芥叶ｃＮＤＡ序列；Ｂ、分别以所述的拟南芥根ｃＮＤＡ序列和拟南芥叶ｃＮＤＡ序列为模板，分别根据拟南芥根特异性基因设计引物，再分别进行半定量ＰＣＲ反应，筛选得到拟南芥根特异性基因ＥＸＰ１８；Ⅱ、获取水稻根特异性表达基因ＥＸＰ１８Ｄ启动子：Ａ、将所述的拟南芥根特异性基因ＥＸＰ１８的序列进行在线分析比对，得到水稻根特异性基因；Ｂ、分别从水稻植株中提取水稻根总ＲＮＡ和水稻叶总ＲＮＡ，再分别进行反转录ＰＣＲ反应，分别扩增得到水稻根ｃＮＤＡ序列和水稻叶ｃＮＤＡ序列；Ｃ、分别以所述的水稻根ｃＮＤＡ序列和水稻叶ｃＮＤＡ序列为模板，分别以所述的水稻根特异性基因设计引物，进行半定量ＰＣＲ反应，筛选得到水稻根特异性表达基因ＥＸＰ１８Ｄ；Ｄ、在线分析得到水稻根特异性表达基因ＥＸＰ１８Ｄ的启动子，再在水稻根ＤＮＡ中进行克隆得到所述的水稻根特异性表达基因ＥＸＰ１８Ｄ启动子。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贾文锁，梁莉艳，赵艳侠，李自超，李金杰，李冰冰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11
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