细菌的[2Fe‑2S]二羟酸脱水酶的鉴定和用途制造技术

发现了具有[2Fe‑2S]簇的二羟酸脱水酶的群体。细菌的[2Fe‑2S]DHAD被作为异源蛋白质在细菌和酵母细胞中表达，提供了用于使2，3‑二羟基异戊酸转化为α‑酮异戊酸和2，3‑二羟基甲基戊酸转化为α‑异亮氨酸酮酸的DHAD活性。异丁醇和其他化合物可以在包括了细菌[2Fe‑2S]DHAD活性的途径中得到合成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细菌的[2Fe-2S]二羟酸脱水酶的鉴定和用途相关申请的交叉引用本专利申请涉及并要求2008年9月29日提交的美国临时申请61/100,792的优先权，该专利全文以引用方式并入本文。专利
本专利技术涉及工业微生物学领域和二羟酸脱水酶活性的表达。更具体地讲，鉴定了具有[2Fe-2S]簇的细菌二羟酸脱水酶，并使其在细菌和酵母宿主中作为异源蛋白质被表达。
技术介绍
二羟酸脱水酶(DHAD)，也叫乙酰羟酸脱水酶，催化2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸和2，3-二羟基甲基戊酸转化为α-异亮氨酸酮酸。被分类为E.C.4.2.1.9的DHAD酶是天然存在的生产缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和泛酸(维生素B5)的生物合成途径的部分。对于增强的支链氨基酸或泛酸的微生物生产，活性DHAD的提高的表达是合乎期望的。2，3-二羟基异戊酸向α-酮异戊酸的DHAD催化的转化也是共同拥有和共同未决的美国专利申请公布US20070092957A1中所公开的多种异丁醇生物合成途径的共同步骤。本文公开的是用于生产异丁醇的重组微生物的改造。异丁醇作燃料添加剂是有用的，其可用性可减少对石油化学燃料的需求。为了提高在包括了二羟酸脱水酶的途径中合成的化合物的生产，在所关注的生产宿主中表达提供这种酶活性的异源酶是合乎期望的。由于这种酶需要Fe-S簇，而这种需求涉及Fe-S簇的可获得性和其向DHAD脱辅基蛋白中的正确装载，二羟酸脱水酶在异源宿主中功能性的高表达的获得是复杂的。需要Fe-S簇的DHAD是本领域已知的，并且被发现以[4Fe-4S]或[2Fe-2S]形式存在。一些细菌的此类酶是已知的，其中被最好地表征的是来自大肠杆菌的(E.coli)(Flint，DH，等人(1993)J.Biol.Chem.268：14732-14742)。然而，这些细菌的酶均为[4Fe-4S]形式。迄今报道的惟一[2Fe-2S]形式是一种菠菜酶(Flint和Emptage(1988)J.Biol.Chem.263：3558-3564)。由于[2Fe-2S]形式在Fe-S簇的合成和/或组装方面造成的负担更小，在宿主细胞中使用[2Fe-2S]形式的这种酶以提高所引入的生物合成途径的生产是合乎期望的。遗憾的是，这种酶仅有一种[2Fe-2S]形式是已知的。因此，存在对鉴定DHAD的新的[2Fe-2S]形式以用于重组宿主细胞中的需求，其中所述重组宿主细胞中，2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸是所期望的生物合成途径中的代谢途径步骤。专利技术概述本文提供了鉴定[2Fe-2S]DHAD酶的方法，所述方法包括：a)用序型隐蔽马尔科夫模型(ProfileHiddenMarkovModel)查询一种或多种氨基酸序列，所述序型隐蔽马尔科夫模型是使用SEQIDNO：164、168、230、232、298、310、344和346的蛋白质制备的，其中具有小于10-5的E值的匹配提供了第一序列子集，从而所述第一序列子集对应于一种或多种DHAD相关蛋白质；b)分析步骤(a)的对应于一种或多种DHAD相关蛋白质的第一序列子集中三个保守的半胱氨酸的存在，从而鉴定出编码[2Fe-2S]DHAD酶的第二序列子集，其中所述三个保守的半胱氨酸对应于变异链球菌(Streptococcusmutans)二羟酸脱水酶氨基酸序列(SEQIDNO：168)的56、129和201位；以及c)分析步骤(b)的第二序列子集中特征保守氨基酸的存在，从而进一步鉴定出编码[2Fe-2S]DHAD酶的第三序列子集，其中所述特征保守氨基酸的位置对应于变异链球菌DHAD氨基酸序列(SEQIDNO：168)中的以下位置：88位的天冬氨酸、142位的精氨酸或天冬酰胺、208位的天冬酰胺和454位的亮氨酸。在本专利技术的另一方面，上述方法进一步包括：d)在细胞中表达具有可通过步骤a)、b)和c)中任何一个或全部步骤鉴定的序列的多肽；以及e)确认所述多肽在细胞中具有DHAD活性。在本专利技术的另一方面，上述方法进一步包括：d)纯化由可通过步骤a)、b)和c)中任何一个或全部鉴定的序列编码的蛋白质；以及e)通过紫外可见(UV-vis)和电子顺磁共振(EPR)光谱法确认所述蛋白质是[2Fe-2S]DHAD酶。在本专利技术的另一方面，上述方法进一步包括选择一种或多种序列，所述序列对应于在步骤a)、b)和c)中任何一个或全部中鉴定的细菌[2Fe-2S]DHAD酶序列。所述选择的序列可在细胞中被表达；并且在该细胞中其DHAD活性可被确认。所述选择的序列可进一步被纯化，从而获得纯化的蛋白质并且所述纯化的蛋白质的[2Fe-2S]DHAD酶活性可通过UV-vis和EPR光谱得到确认。本专利技术的另一方面涉及微生物宿主细胞，所述宿主细胞包含至少一种可通过本文所述方法鉴定的异源[2Fe-2S]DHAD酶。所述细胞可以是细菌细胞或酵母细胞。所述细胞还可以是生产异丁醇的重组细胞。本专利技术的另一方面是用于生产异丁醇的方法，所述方法包括：a)提供包含至少一种可通过本文所述方法鉴定的异源[2Fe-2S]DHAD酶的微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步包含异丁醇生物合成途径；和b)使(a)的微生物宿主细胞在使异丁醇产生的条件下生长。本专利技术的另一方面是用于使2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的方法，所述方法包括：a)提供包含通过本文所述方法鉴定的至少一种异源[2Fe-2S]DHAD酶的微生物宿主细胞和2，3-二羟基异戊酸源；和b)使(a)的微生物宿主细胞在使2，3-二羟基异戊酸被转化为α-酮异戊酸的条件下生长。附图说明和序列描述通过下面的具体实施方式、附图和随附的序列描述可以更全面地理解本专利技术，这些详细描述、附图和序列描述形成了本专利申请的一部分。图1显示在代表性的细菌[2Fe-2S]DHAD和[4Fe-4S]DHAD中的保守的半胱氨酸区域，以粗体的C表示半胱氨酸。采用单字母的氨基酸缩写。图2显示DHAD相关蛋白的系统发育树。标记了关于[4Fe-4S]和[2Fe-2S]DHAD，以及EDD、醛糖酸脱水酶和未确定的类群(Und)的分枝。标记了选择的个别DHAD。图3显示用于异丁醇生产的生物合成途径。图4显示A)变异链球菌DHAD，和B)大肠杆菌DHAD在空气中的活性稳定性的图。图5显示变异链球菌DHAD的紫外-可见光谱的曲线图。图6显示变异链球菌DHAD在介于20°K和90°K之间的不同温度的电子顺磁共振(EPR)光谱的曲线图。图7显示对表达乙酰乳酸合酶、KARI和变异链球菌DHAD基因的酵母细胞提取物的HPLC分析，在47.533分钟有异丁醇峰。图8显示乳酸乳球菌(L.lactis)DHAD在空气中稳定性的图。图9显示纯化的乳酸乳球菌DHAD的紫外-可见光谱的曲线图。表1是基于如实施例1中所述制备的、具有经过检验的功能的酶针对二羟酸脱水酶的序型HMM的表。表1以电子方式附于本文提交，并以引用方式并入本文。下列序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”)并且符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)和EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)，以及行政性指示的208节和附录C)。用于本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．用于鉴定［２Ｆｅ－２Ｓ］ＤＨＡＤ酶的方法，所述方法包括：ａ）用序型隐蔽马尔科夫模型查询一种或多种氨基酸序列，所述序型隐蔽马尔科夫模型是使用ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６４、１６８、２３０、２３２、２９８、３１０、３４４和３４６的蛋白质制备的，其中具有小于１０－５的Ｅ值的匹配提供了第一序列子集，从而所述第一序列子集对应于一种或多种ＤＨＡＤ相关蛋白质；ｂ）分析步骤（ａ）的对应于一种或多种ＤＨＡＤ相关蛋白质的第一序列子集中三个保守的半胱氨酸的存在，从而鉴定出编码［２Ｆｅ－２Ｓ］ＤＨＡＤ酶的第二序列子集，其中所述三个保守的半胱氨酸对应于变异链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）二羟酸脱水酶氨基酸序列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６８）的５６、１２９和２０１位；以及ｃ）分析步骤（ｂ）的第二序列子集中特征保守氨基酸的存在，从而进一步鉴定出编码［２Ｆｅ－２Ｓ］ＤＨＡＤ酶的第三序列子集，其中所述特征保守氨基酸的位置对应于变异链球菌ＤＨＡＤ氨基酸序列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６８）中的以下位置：８８位的天冬氨酸、１４２位的精氨酸或天冬酰胺、２０８位的天冬酰胺和４５４位的亮氨酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US61/1007922008年9月29日1.用于鉴定[2Fe-2S]DHAD酶的方法，所述方法包括：a)用序型隐蔽马尔科夫模型查询一种或多种氨基酸序列，所述序型隐蔽马尔科夫模型是使用SEQIDNO：164、168、230、232、298、310、344和346的蛋白质制备的，其中具有小于10-5的E值的匹配提供了第一序列子集，从而所述第一序列子集对应于一种或多种DHAD相关蛋白质；b)分析步骤(a)的对应于一种或多种DHAD相关蛋白质的第一序列子集中三个保守的半胱氨酸的存在，从而鉴定出编码[2Fe-2S]DHAD酶的第二序列子集，其中所述三个保守的半胱氨酸对应于变异链球菌(Streptococcusmutans)二羟酸脱水酶氨基酸序列SEQIDNO：168的56、129和201位；以及c)分析步骤(b)的第二序列子集中特征保守氨基酸的存在，从而进一步鉴定出编码[2Fe-2S]DHAD酶的第三序列子集，其中所述特征保守氨基酸的位置对应于变异链球菌DHAD氨基酸序列SEQIDNO：168中的以下位置：88位的天冬氨酸、142位的精氨酸或天冬酰胺、208位的天冬...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·弗林特，
申请(专利权)人：布特马斯先进生物燃料有限责任公司，
类型：发明
国别省市：US