【课题】提供可不使用二甲基亚砜等的有害的冷冻保存剂地安全地冷冻保存包括人的动物或植物的细胞或组织的冷冻保存用组合物。另外，提供向食品或药品的冷冻保存或冷冻干燥制品的应用。【解决手段】使ε－聚－Ｌ－赖氨酸与无水琥珀酸反应使而阻断ε－聚－Ｌ－赖氨酸的氨基的６０％以上。将如此得到的高分子化合物以７．５ｗ／ｗ％溶解于市售的培养液之一的Ｄｕｌｂｅｃｃｏ－改良的Ｅａｇｌｅ培养基（ＤＭＥＭ）中而作为冷冻保存液。另外，向食品或药品添加０．５～１０％ε－聚－Ｌ－赖氨酸琥珀酸衍生物而防止冷冻浓缩。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞及组织的冷冻保存用组合物
本专利技术涉及人及动物细胞及组织的冷冻保存用试剂，其能减轻在冷冻及解冻细胞 及组织时对细胞及组织的损伤或伤害。此冷冻保存技术预期在需要冷冻保存活的组织(例 如皮肤，角膜，胰岛及心脏瓣膜)的移植医学中，及在需要冷冻保存细胞(例如造血干细胞， 间叶干细胞，胚胎干细胞，iPS细胞(诱导的多能干细胞)等)的再生医学中高度需求。
技术介绍
在0°C或以下温度的冷冻保存技术常规用于长-时间保存带水的或含水物质(例 如植物及动物的细胞及组织以及食品)。已知冷冻这些物质时，冰晶形成，得到不均勻浓度 的被水分子排除的溶质及混入物，称为‘冷冻浓缩’。为阻止冷冻浓缩，可将各低分子量化合物加入冷冻保存介质。例如，加入二甲基亚 砜(DMSO)，甘油等作为冷冻-保护剂，以最小化由冷冻保存过程中细胞中的结晶化的水导 致的对细胞及组织的损伤。因此，细胞通常悬浮于冷冻管中的含5 20%冷冻保存剂(例如DMS0，甘油，乙二 醇及丙二醇)的生理溶液，培养基中，及于低温，-80°C或-196°C保存。这些试剂中，DMSO是最有效的及常采用的，但其在生理学上有毒，及已知当将细胞 输注到受者时导致高血压，恶心及呕吐。而且，DMSO毒性倾向于衰减解冻的细胞培养或输 注到受者身体后细胞的存活率和/或功能。这些试剂中，甘油具有更低冷冻保存效果，及要求仅于室温或非冷冻低温保持细 胞悬浮液后冷冻，或通过使用程序冷冻器等精确控制降低的温度。而且，因为它们对细胞生 存及功能的低保护效果，所述冷冻保存剂对解冻的细胞有害。冷冻保存干细胞(例如胚胎干细胞或iPS细胞)或生殖细胞(例如精子，未受精 的或受精卵)中，用高浓度的冷冻保护剂(例如DMS0，乙酰胺，丙二醇及聚乙二醇)进行快 速冷冻或玻璃化。玻璃化快速致使细胞内水成为玻璃化状态，以避免冰晶形成所致的对细 胞的伤害或损伤。还是，细胞或组织被浓的冷冻保存剂的高毒性损伤非常可能；因此，此技 术仅在一些有限情况中采用。制备药学产品，食品及用于展示目的的冰雕中，使用例如氯化钠或糖，葡萄糖及海 藻糖的添加剂。也使用其他由生物(例如植物，鱼及昆虫)制得的例如抗冷冻蛋白或抗冷 冻糖蛋白的添加剂(特开2005-126533及特开2003-250506)。燃料电池中，水通过电化学反应在任何一个电极产生。例如，在质子-交换膜燃料 电池中，水在阴极电极产生；及产生的一部分水通过电解质膜向阳极侧移动。水也将从进入 电池的气体中的蒸汽冷凝产生。这些水潜在地阻碍气流，耗竭气体本身的供给及最终降低 电池表现。这些错杂可通过用亲水包被材料(例如蛋白)处理气体分隔物表面，由此限制水 冷凝来防止，但液体水甚至在所述条件下于低温偶尔冷冻导致其他错杂。为防止此问题，将 有抗冷冻蛋白的聚合物电解质加入树脂层，其然后包被聚合物电解质膜表面(下列Adler 等人)，但此方法具有高成本的问题。现有技术文献专利文献专利文献1特表平10-51140专利文献2专利第3694730号专利文献3特开2005-12653专利文献4特开2OO3-25O5Oe专利文献5特开2008-04159非专利文献非专利文献IlLovelock JE and Bishop MWH, Nature 183 1394-1395,1959非专利文献2Polge C, Smith AU, Parkes AS, Nature 164 :666_666，1949非专利文献3Miszta-Lane H, Gill P, Mirbolooki M, LakeyJRT. Cell Preserv Technol 5，16-24，200非专利文献4Ha SY, Jee BC, Suh CS, Kim HS, Oh SK, Kim SH, Moon SY. Human Reproduction 20，1779-1786，200非专利文献5Yu ΗΝ, Lee YR, Nob EM，et al. INT JHEMAT0L = 87 189-194 ；2008非专利文献 6Adler S, Pellozzer C, Paparella Μ, Hartung Τ, Bremer S.Toxicol in Vitro 20 :265_271 ；200
技术实现思路
专利技术要解决的技术课题常规冷冻保存方法(包括快速冷冻技术)在冷冻及解冻后不可保存细胞或组织的 完全结构完整性；因此，非常需要有低毒性的新冷冻保存物质。而且，已知DMSO诱导细胞 (例如HL-60细胞)分化；因此，其不适于某些类型的细胞。抗冷冻蛋白及糖蛋白具有优良 的保存能力，但用于食物成本太高(JPY1，300，000YEN/g)，更别提用于细胞及组织。本专利技术旨在提供具有优良的保护效果及对于细胞或组织的低毒性的冷冻保存剂， 从而取代DMSO。本专利技术也旨在提供廉价的及安全的具有类似于抗冷冻蛋白及糖蛋白的阻止 冷凝的性质的冷冻保存剂，从而以使冷冻保存及冷冻干燥物质(例如食品及药学产品)。解决课题的技术方案本专利技术的冷冻保存液包括基本上1 50%的具有侧链氨基的聚胺；及生理溶液 (例如盐水或培养基)。专利技术效果通过将各动物细胞(包括人细胞)及植物细胞浸入冷冻保存液然后于-80°C冷冻 保存或用液体或蒸汽氮冷却下，而能不使用高度毒性DMSO或其他常规冷冻保存剂而保持 它们的存活率及生物活性地保存。因为未使用常规冷冻保存剂(例如DMS0，甘油，乙二醇) 等，对细胞的毒性保持低，及能不降低细胞的生物活性地长时间冷冻保存细胞。而且，冷冻 保存液无蛋白成分(例如胎牛血清及白蛋白)，因此，无感染疾病的担忧，及不受偶尔见于 由生物材料制成的药学产品的巨大变化的影响。具有侧链氨基的聚胺(例如ε _聚-L-赖氨酸及聚烯丙胺)由于侧链氨基而具有 与细胞膜的亲和力，因此，认为具有细胞保护效果。具有丰富的羧基的聚合物化合物也具有与水的高亲和性，因此，将在冷冻过程中，将细胞内水辅助移出到周围的培养基，由此预期 具有冷冻保存效果。以足够的比例兼有氨基及羧基的聚合物化合物预期在冷冻时具有对细 胞的进一步改善的冷冻保存效果。因此，本专利技术以提供具有高有效性及高安全性的冷冻保 存液为目标，锐意研究了具有阳离子基团(例如侧链氨基)的聚合物化合物(例如聚氨基 酸)，或具有阴离子基团(例如羧酸基)的聚合物化合物、以及兼有阳离子及阴离子基团的 聚合物化合物的条件或要求。本专利技术的冷冻保存剂相比DMSO毒性小，及不要求细胞或组织解冻后洗涤。然后可 将解冻的细胞或组织直接悬浮于培养基中，以立即开始培养处理。可根据本专利技术稳定地进行实验用培养细胞的冷冻保存；及而且期望能通过保持功 能细胞(例如胰岛及干细胞(例如ES细胞，间叶干细胞及iPS细胞))的细胞功能来保存。 因此，预期改善这些细胞的移植效率。通过使用本专利技术的非冷冻聚_氨基酸，能阻止具有生理物质的带水物质的冷冻过 程中的生理物质的钝化。而且，通过使用非冷冻聚-氨基酸，可在通过带水或含水物质的冷 冻或冷冻干燥来获得冷冻的产品或冷冻干燥的产品的过程中达到不同于水分子的成分的 均勻扩散。冷冻的产物可为冰淇淋，果汁牛奶冻，其他冷冻甜食，展览用冰，速冻汤等；及冷 冻干燥产品可为冷冻干燥的粉末形式的食品或药学产品。本专利技术的非冷冻试剂也可应本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．细胞及组织的冷冻保存用组合物，其包括：●聚合物化合物，■其包括具有氨基的单元的聚合物，及■其选自：ε－聚－Ｌ－赖氨酸，α－聚－Ｌ－赖氨酸，聚－精氨酸，其他聚－氨基酸，导入氨基的多糖类及聚烯丙胺；及●生理溶液；及将所述聚合物化合物溶于所述生理溶液至１～５０ｗ／ｗ％。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：松村和明，
申请(专利权)人：博傲沃德株式会社，
类型：发明
国别省市：JP
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