牛生殖细胞的冷冻保存用组合物和冷冻保存方法技术

本发明专利技术提供了一种牛精子等的牛生殖细胞的冷冻保存液以及冷冻保存方法。使用在生理溶液中溶解了0.3～0.9w/w％的对数均分子量为1000～20000的ε‑聚赖氨酸的氨基的50～99％(摩尔)与琥珀酸酐发生反应而引入适当量的羧基的两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)和2～4w/w％的甘油的冷冻保存液。在冷冻保存方法的优选实施方式中，包括：用生理溶液将牛的精液稀释至2.5～10倍，并在2～8℃保持的第一稀释工序；以及保持在2～8℃的同时，通过点滴将添加有两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)和甘油的生理溶液添加到通过第一稀释工序获得的悬浮液中，进一步稀释将牛的精液稀释至5～20倍的第二稀释工序。

Compositions for cryopreservation of bovine germ cells and methods for cryopreservation

The invention provides a cryopreservation solution for bovine germ cells such as bovine sperm and a cryopreservation method. A cryopreservation solution containing amphoteric polymer electrolyte (antifreeze poly-amino acid) containing carboxyl group and glycerol of 2-4w/w% was introduced by reacting 50-99% (mole) of the amino group of epsilon polylysine dissolved in 0.3-0.9w% logarithmic average molecular weight of 1000-20000 with succinic anhydride in physiological solution. In the preferred embodiments of freezing preservation methods, bovine semen is diluted to 2.5-10 times with physiological solution, and the first dilution process is maintained at 2-8 degrees Celsius; and the physiological solution with amphoteric polymer electrolyte (antifreezing poly-amino acid) and glycerol is added to the suspension obtained through the first dilution process by dropping at 2-8 degrees Celsius. The second dilution process, which dilutes bovine semen to 5-20 times.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】牛生殖细胞的冷冻保存用组合物和冷冻保存方法
本专利技术涉及一种例如对于牛生殖细胞的冷冻保存有用的冷冻保存用组合物以及冷冻保存方法。
技术介绍
为了长期保存动物的细胞或者组织，日常使用在0℃以下温度的冷冻保存方法。然而，当动物的细胞或者组织包含水而进行冷冻时，由于在冷冻中水分子一边排除溶质和混入物的介质一边结晶化，形成仅由水分子形成的冰晶，因此在含水物中溶质和混入物的介质不均匀地扩散，而发生冷冻浓缩。为了防止这种冷冻浓缩，进行了添加各种低分子化合物的方法。例如，在进行细胞的冷冻保存时，为了将冷冻保存中引起的因细胞内的结晶化对细胞造成的损害抑制到最低限度，进行了添加低分子的二甲基亚砜或甘油等作为冷冻保护剂的方法。特别是，为了提高牛的子畜生产力，开发一种对牛生殖细胞有用的冷冻保存方法变得重要。例如，作为用于冷冻牛精子的冷冻保护剂，已知有甘油。另外，作为用于冷冻牛卵子以及胚胎的冷冻保护剂，已知有甘油、乙二醇、丙二醇。进一步地，作为用于冷冻牛体细胞的冷冻保护剂，已知有二甲基亚砜。然而，这些以往的冷冻保护剂无论哪一种都存在细胞毒性强这样的问题。同时，PCT/JP2009/002941(日本专利特本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛精子的冷冻保存液，为用于使牛精子悬浮并冷冻的牛精子的冷冻保存液，其特征在于，包含：0.3～0.9w/w％的两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)，包含由下式(I)所示的结构单元以及由下式(II)所示的结构单元，并且由下式(II)所示的结构单元的比例为50～99mol％；以及2～4w/w％的甘油，

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.22 JP 2016-1622121.一种牛精子的冷冻保存液，为用于使牛精子悬浮并冷冻的牛精子的冷冻保存液，其特征在于，包含：0.3～0.9w/w％的两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)，包含由下式(I)所示的结构单元以及由下式(II)所示的结构单元，并且由下式(II)所示的结构单元的比例为50～99mol％；以及2～4w/w％的甘油，2.根据权利要求1所述的牛精子的冷冻保存液，其特征在于，所述冷冻保存液为将防冻聚氨基酸和甘油添加到Dulbecco改良培养基(DMEM)、Eagle的MEM培养基(MEM)、其他的细胞用培养液或者其他的生理溶液中，同时调整pH范围为7.0～8.0，进而添加源自牛精液的液体以使所述源自牛精液的液体为5～20w/w％的水溶液。3.一种牛精子的冷冻保存方法，其特征在于，包括：通过添加了包含由下式(I)所示的结构单元和由下式(II)所示的结构单元并且由下式(II)所示的结构单元的比例为50～99mol％的两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)和甘油的生理溶液，将牛的精液稀释至5～20倍，使牛精子悬浮在包含0.3～0.9w/w％的两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)、2～4w/w％的甘油以及源自于牛的精液的一部分的冷冻保存液中的稀释工序；使牛精子悬浮的冷冻保存液冷冻在管状的容器中的工序；以及之后保持在-60℃以下的温度进行保存的工序，4.根据权利要求3所述的牛精子的冷冻保存方法，其特征在于，所述稀释工序包括：用生理溶液将牛的精...

【专利技术属性】
技术研发人员：窪田力，安藤贵朗，玄丞烋，玄优基，今村修二，月精悟，
申请(专利权)人：博傲沃德株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP