一种GV期卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法技术

一种GV期卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法。它涉及一种卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法。本发明专利技术解决了现有卵母细胞冷冻保存解冻后存活率及发育率低的问题。卵母细胞冷冻采用cryoloop为载体，以常规培养液为基质，以DMSO和乙二醇为冷冻保护剂，冷冻、解冻过程中添加维生素B12和叶酸。本发明专利技术可有效提高解冻后卵母细胞存活率和体外发育率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法。
技术介绍
哺乳动物卵母细胞的冷冻保存指在超低温（_196°C )条件下抑制细胞内一切新陈 代谢活动，并使细胞被长期保存，按一定的方式解冻后，又能恢复其受精、卵裂等发育潜能 的一种保存技术。卵母细胞冷冻保存能够充分利用各种来源的卵母细胞，可为体外受精、核 移植、转基因等胚胎工程技术的研究和应用提供大量的实验材料，且不受时间和空间的限 制。 卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存，由于细胞自身所具有的一系列特 殊性质，因而冷冻保存的难度较大，其冷冻效果远远不及胚胎的冷冻水平。卵母细胞体积 大，内部水分含量高，内容物丰富，如卵母细胞中含有的大量脂肪粒和囊泡等对低温十分敏 感，使得卵母细胞的冷冻保存受到了很大的限制。因此，建立完善的卵母细胞冷冻保存方法 尤为重要。目前较为常用的卵母细胞冷冻保存技术方法有慢（快）速冷冻法和玻璃化冷 冻法。由于玻璃化冷冻法是一种快速降低细胞温度的冷冻模式，避免了慢速冷冻过程中细 胞遭受的机械损伤，同时缩短了冷冻处理时间，简化了步骤，并且不需要昂贵的程序降温仪 器，逐渐成为胚胎和卵母细胞冷冻保存的趋势。 卵母细胞成熟过程主要分为以下几个时期，生发泡（Germinalvesicle，GV)期、 进入成熟状态的生发泡破裂（Germinalvesiclebreakdown，GVBD)和之后的减数分裂 (Mei 〇Sis，M)期；减数分裂又分为M I期和M II期，M I进一步细分为中期I、后期I、末期 I。相比之下，以生发泡（Germinalvesicle，GV)期卵母细胞为冷冻对象比成熟卵母细胞更 具有优势。 尽管目前采用玻璃化冷冻法冷冻保存GV期卵母细胞已经取得很大的进展，但是 冷冻解冻后的卵母细胞受精卵裂率、囊胚发育率仍然不理想。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有卵母细胞冷冻保存解冻后卵母细胞受精卵裂率、囊胚发育率 低的问题，提供一种GV期卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法。 卵母细胞冷冻保存平衡液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇、二 甲基亚砜（DMS0)和海藻糖组成；平衡液中胎牛血清的体积浓度为10%、维生素B 12的浓度 为2mg/ml、叶酸的浓度为100 yM、乙二醇的体积浓度为7. 5%、二甲基亚砜的体积浓度为 7. 5%、海藻糖的浓度为0. 25M。 卵母细胞冷冻保存液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇和二甲基 亚砜组成；冷冻保存液中胎牛血清的体积浓度为10%、维生素B 12的浓度为2mg/ml、叶酸的 浓度为100 yM、乙二醇的体积浓度为15%、二甲基亚砜的体积浓度为15%。 卵母细胞冷冻保存解冻液分有解冻液I和解冻液II两种；解冻液I和解冻液II均 由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸和海藻糖组成，解冻液中胎牛血清的体积浓度为 10%、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为lOOyM，解冻液I中海藻糖的浓度为1M， 解冻液II中海藻糖的浓度为0. 5M。 卵母细胞按以下步骤进行冷冻保存： 将GV期卵母细胞在平衡液中平衡3分钟，然后转移到冷冻保存液中，再立即转移 到冷冻环上，并迅速投入液氮中冷冻； 其中，平衡液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇、二甲基亚砜和海 藻糖组成；平衡液中胎牛血清的体积浓度为10%、维生素B 12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度 为100 yM、乙二醇的体积浓度为7. 5%、二甲基亚砜的体积浓度为7. 5%、海藻糖的浓度为 0. 25M； 冷冻保存液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇和二甲基亚砜组 成；冷冻保存液中胎牛血清的体积浓度为10%、维生素B 12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为 100 yM、乙二醇的体积浓度为15%、二甲基亚砜的体积浓度为15%;所述常规培养液为DMB1培养液、TCM199培养液、M16或培养液。 冷冻卵母细胞按以下步骤进行解冻： 将冷冻保存的卵母细胞从液氮中取出立即放到解冻液I中3分钟，再转移到解冻 液II中3分钟，之后转移到基础液中3分钟，即完成冷冻卵母细胞的解冻；其中，解冻液I由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸和海藻糖组成，解冻液I 中胎牛血清的体积浓度为10%、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100 y M、海藻糖 的浓度为1M ;解冻液II由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸和海藻糖组成，解冻液II 中胎牛血清的体积浓度为10%、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100 y M、海藻糖 的浓度为〇. 5M。 基础液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12和叶酸组成；基础液中胎牛血清的体 积浓度为1〇%、维生素队 2的浓度为211^/1]11、叶酸的浓度为100以|/[。常规培养液为DMB1培养液、TCM199培养液、M16或培养液。 本专利技术GV期卵母细胞可为哺乳动物或人的GV期卵母细胞。 本专利技术卵母细胞冷冻保存平衡液、冷冻液和解冻液可有效提高解冻后卵母细胞经 体外受精和孤雌激活后的胚胎发育率。采用本专利技术解冻后经体外成熟后受精，囊胚率提高 了 7. 2 %，孤雌激活囊胚率提高了 3 %。 本专利技术GV期卵母细胞冷冻保存方法能够降低玻璃化冷冻引起的损伤，提高卵母 细胞冷冻保存存活率，提高冷冻保存后卵母细胞发育能力，而且成本低廉，便于广泛推广。【具体实施方式】 本专利技术技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。【具体实施方式】一：本实施方式卵母细胞冷冻保存平衡液由常规培养液、胎牛血清、 维生素B12、叶酸、乙二醇、DMS0和海藻糖组成；平衡液中胎牛血清的体积浓度为10%、维生 素B 12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100 yM、乙二醇的体积浓度为7. 5%、二甲基亚砜的 体积浓度为7. 5%、海藻糖的浓度为0. 25M ;常规培养液为DMEM培养液、TCM199培养液、M16 或MEM培养液。【具体实施方式】 二：本实施方式卵母细胞冷冻保存液由常规培养液、胎牛血清、维生 素B 12、叶酸、乙二醇和DMS0组成；其中胎牛血清的体积浓度为10%、维生素B12的浓度为 211^/1111、叶酸的浓度为100 1^、乙二醇的体积浓度为15%、01^0的体积浓度为15%;常规培 养液为DMEM培养液、TCM199培养液、M16或MEM培养液。【具体实施方式】 三：本实施方式卵母细胞冷冻保存解冻液分有解冻液I和解冻液II 两种；解冻液I和解冻液II均由常规培养液、胎牛血清、维生素B 12、叶酸和海藻糖组成，解 冻液中胎牛血清的体积浓度为10%、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100 y M，解 冻液I中海藻糖的浓度为1M，解冻液II中海藻糖的浓度为0. 5M;其中，常规培养液为DMEM 培养液、TCM199培养液、M16或MEM培养液。【具体实施方式】 四：本实施方式卵母细胞按以下步骤进行冷冻保存： 将GV期卵母细胞在平衡液中平衡3分钟，然后转移到冷冻保存液中，再立即转移 到冷冻环上，并迅速投入液氮中冷冻； 其中，平衡液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二本文档来自技高网...

【技术保护点】
卵母细胞冷冻保存平衡液，其特征在于平衡液由常规培养液、胎牛血清、维生素B12、叶酸、乙二醇、二甲基亚砜和海藻糖组成；其中胎牛血清的体积浓度为10％、维生素B12的浓度为2mg/ml、叶酸的浓度为100μM、乙二醇的体积浓度为7.5％、DMSO的体积浓度为7.5％、海藻糖的浓度为0.25M。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹新燕，许保增，李晓霞，王世勇，刁云飞，薛海龙，刑明杰，赵蒙，赵伟刚，魏海军，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22