通过改进谷物产量和品质增加谷物价值的方法技术

本发明专利技术提供了转基因植物，其表达编码柠檬酸合酶（ＣＳ）的转基因，其中本发明专利技术的转基因植物种子的特征是：与不表达该转基因的同基因品系相比较时，蛋白质、必需氨基酸或油的产量增加和／或水平增强；并且本发明专利技术也提供了产生具有经济相关性状的转基因植物的方法并提供了包含编码柠檬酸合酶的多核苷酸的表达载体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术背景 专利
本专利技术涉及表达转基因柠檬酸合酶(⑶)的转基因植物和使用方法。与同基因品 系对照(isoline control)相比较时，表达转基因CS的转基因植物、特别是在种子中表达 或在种子中表达并进一步靶向细胞区室如质体时的转基因植物具有更高水平的谷物产量 和/或氨基酸、尤其半胱氨酸、和/或油，其中所述的同基因品系对照不含有与种子偏好的 启动子连接或还与细胞区室靶向序列有效连接的转基因。
技术介绍
禾谷植物谷粒是人和动物的最重要可再生能量来源之一。随着世界人口增加并且 可耕地有限，对食物、饲料、纤维和生物燃料的需求正在增加。增加每英亩谷物产量和增强 每英亩谷物营养价值以满足这些需求是必需的和非常宝贵的。由于超过90%的谷物粒现 今用于动物饲料和乙醇生产，谷物是动物营养的最重要作物之一。黄色凹陷谷物的谷粒由 60-70%淀粉、8-10%蛋白质和3-4%油组成。但是，即便含有这些有价值的饲料组分，黄色 凹陷谷物不含有充分的热量和必需氨基酸以支持大多数动物中的最佳生长和发育。因此， 为弥补这些缺点，需要用其他养分补充基于黄色凹陷谷物的饲料。最常见地，黄色凹陷谷物 与豆粕混合以改善饲料的氨基酸组成。不幸地，动物缺少消化豆粕中存在的非淀粉基于的 多糖必需的酶，并且谷物和大豆饲料混合物产生高的粪便体积。此外，豆粕昂贵。另外，为 改进热量含量，基于谷物的动物饲料也用脂肪补充，如动物内脏和饲料级动物脂肪和植物 脂肪，所述的脂肪可以包括餐馆、制皂和精炼工业的副产品。使用动物下水来补充牛饲料已 经停止了，因为它与有关牛海绵状脑病和克-雅氏病有关。改善谷物产量和谷物粒的营养 品质将增加每英亩价值、每英亩能量，并且改善饲料效率并减少对环境的影响和与肉生产 相关的其他成本。呼吸作用，包括三羧酸(TCA)循环，不仅提供用于合成贮藏化合物的能量，还产生 用于油和氨基酸生物合成的中间体。柠檬酸合酶(⑶)催化柠檬酸从草酰乙酸和乙酰CoA形 成。这是TCA循环中的第一关键步骤，所述的TCA循环通常存在于线粒体中。CS在TCA循环 和代谢中发挥重要作用。已经尝试工程化柠檬酸合酶以改进作物生产力。US2005/0137386 描述了用于获得具有改善的养分摄取能力和有毒化合物耐受性的转基因植物的方法，其 中所述的有毒化合物存在于土壤中。de la Fuente等人所做的研究显示，烟草中铜绿假 单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)柠檬酸合酶基因的表达提高铝耐受性(Science 276 1566-1568，1997)。Lopez等人报道了因有机酸增溶磷酸盐的低可溶形式所致增强的磷摄取 (Nature Biotech 18 :450_453，2000)。但是，这种方法似乎受环境影响，因为使用这些相同 的植物以及被工程化表达柠檬酸合酶基因至更高水平的植物，另一个研究小组不能够重复 这些研究结果(Delhaize 等人 Plant Physiology 125 :2059-2067,2001) WO 2004/056968公开了通过近红外光谱法测量时，与非转基因对照相比较，拟南芥属(Arabidopsis)柠檬酸合酶基因(At3g58750)的过量表达引起籽油增加多 达7%。美国专利申请公开号2003/0233670和2005/0108791公开了来自苛养木杆菌 (Xyllelafastidia)、大肠杆菌(E. coli)、稻、玉米和大豆的柠檬酸合酶和它们在改善转基 因植物的磷酸盐摄取中的用途。已经报道了过量表达线粒体形式和胞质形式的柠檬酸合酶 改善模型植物中的磷酸盐摄取(Lopez-Bucio等人，2000 ;Kayama等人，2000)。但是，存在 以下报道烟草中铜绿假单胞菌柠檬酸合酶基因的表达与增强的柠檬酸积累或流出不相关 (Plant Physiology，2001，第125卷2059-2067)。所述作者提出植物中的CS表达不太可 能是用于增强作物的铝耐受性和磷营养的有力和轻易可再现策略。尽管结合的氨基酸(蛋白质组成)占据谷物种子中90-99%的总氨基酸，但是游 离氨基酸占据1-10%的总氨基酸。存在进一步增加必需氨基酸含量的严重挑战。一个挑 战是增加游离氨基酸浓度不总是导致总氨基酸增加，因为游离氨基酸流和掺入蛋白质可以 变得有限的。再者，游离氨基酸的积累经常与不利的农艺性能如矮化生长(因而影响销售 性)相关。从营养品质角度看，理想谷粒将是具有改善含量的油、蛋白质和必需氨基酸如缬 氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和/或精氨酸的谷粒。持续存在对增加的谷物产量和对下述植物谷粒的需求，其中所述的植物谷粒具有 想要的农艺特征和提高的必需氨基酸、蛋白质或油水平。专利技术概述本专利技术提供了在转基因植物种子中或在种子的胞内区室中表达编码柠檬酸合酶 (CS)蛋白的基因的转基因植物和其部分，其中与不以这种方式表达转基因柠檬酸合酶蛋白 的同基因品系(isoline)植物或种子相比较时，该CS赋予更高水平的谷物产量和/或更高 水平的氨基酸(如半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、苏氨酸、赖氨酸和/或缬氨酸)和/或油。 本专利技术也包括使用本文中所述多核苷酸和载体以赋予所得转基因植物和其部分经济重要 性状的方法。在一个实施方案中，本专利技术提供了转基因植物和其部分，其包含在种子中或在种 子的胞内细胞区室中表达的编码异源柠檬酸合酶的多核苷酸，其中多核苷酸选自由以下多 核苷酸组成的组a)具有如SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的 多核苷酸；b)编码具有如SEQ ID而16、17、18、19、22、23、对或25中所定义序列的多肽的 多核苷酸；c)与具有如SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核 苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；d)编码与具有如SEQ ID N0:16、17、18、19、22、 23,24或25中所定义序列的多肽具有至少70%序列同一性的多肽的多核苷酸；e)在严格 条件下与具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、13、14或15中所定义序列的多核苷酸杂交 的多核苷酸；f)在严格条件下与编码具有如SEQ ID而16、17、18、19、22、23、对或25中所 定义序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸；和g)与a)至f)的任一多核苷酸互补的多 核苷酸。前述转基因植物的额外实施方案提供了该植物是单子叶植物或双子叶植物，或更 具体地，该植物选自由玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、香蕉、黑麦草、豌豆、苜蓿、大 豆、胡萝卜、旱芹、番茄、马铃薯、棉花、烟草、辣椒、油菜籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、青花 椰菜、莴苣和拟南芥(Arabidopsis thaliana)组成的组。前述转基因植物的又一实施方案 提供了，其中该多核苷酸的表达能够赋该植物经济相关的性状并进一步其中该经济相关性 状选自由以下性状组成的组油含量超过同基因品系油含量增加至少2%、半胱氨酸含量超过同基因品系半胱氨酸含量增加至少4%和每英亩蒲式耳产量超过同基因品系每英亩蒲 式耳产量增加至少3蒲式耳。前述转基因植物的另一个实施方案提供其中植物在谷物本文档来自技高网...

【技术保护点】
转基因植物和其部分，包含编码异源柠檬酸合酶的多核苷酸，该多核苷酸在种子中或在种子的胞内细胞区室中或在种子的胞质中表达，其中多核苷酸选自由以下多核苷酸组成的组：　　ａ）具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５或６中所定义序列的多核苷酸；ｂ）编码具有ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１８中所定义序列的多肽的多核苷酸；　　ｃ）与具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５或６中所定义序列的多核苷酸具有至少７０％序列同一性的多核苷酸；　　ｄ）编码与具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８中所定义序列的多肽具有至少７０％序列同一性的多肽的多核苷酸；　　ｅ）在严格条件下与具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５或６中所定义序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；　　ｆ）在严格条件下与编码具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８中所定义序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸；和　　ｇ）与ａ）至ｆ）的任一多核苷酸互补的多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US61/061,2312008年6月13日1.转基因植物和其部分，包含编码异源柠檬酸合酶的多核苷酸，该多核苷酸在种子中 或在种子的胞内细胞区室中或在种子的胞质中表达，其中多核苷酸选自由以下多核苷酸组 成的组a)具有SEQID NO :5或6中所定义序列的多核苷酸；b)编码具有SEQID NO 18中所定义序列的多肽的多核苷酸；c)与具有SEQID NO :5或6中所定义序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多 核苷酸；d)编码与具有SEQID NO :18中所定义序列的多肽具有至少70%序列同一性的多肽的 多核苷酸；e)在严格条件下与具有SEQID NO :5或6中所定义序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；f)在严格条件下与编码具有SEQID NO :18中所定义序列的多肽的多核苷酸杂交的多 核苷酸；和g)与a)至f)的任一多核苷酸互补的多核苷酸。2.从权利要求1的植物产生的种子，其中多核苷酸在种子中的表达赋予该种子在同基 因品系中不存在的或不以同基因品系中相同水平存在的经济相关性状。3.权利要求2的种子，其中经济相关性状是谷物产量相对于同基因品系而言增加每英 亩至少3蒲式耳。4.权利要求1的植物，其中多核苷酸具有SEQID NO :5或6中所定义的序列或多核苷 酸编码具有SEQ ID NO 18中所定义序列的多肽。5.权利要求1的植物，其中多核苷酸与具有SEQID NO :5或6中所定义序列的多核苷 酸具有至少70%序列同一性或多核苷酸编码与具有SEQ ID NO :18中所定义序列的多肽具 有至少70%序列同一性的多肽。6.权利要求1的植物，其中植物是单子叶植物、双子叶植物或选自由玉米、小麦、稻、 大麦、燕麦、黑麦、高粱、香蕉、黑麦草、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、旱芹、番茄、马铃薯、棉花、 烟草、辣椒、油菜籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、青花椰菜、莴苣和拟南芥(Arabidopsis thaliana)组成的组。7.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：关汉平，
申请(专利权)人：巴斯夫植物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：DE