本发明专利技术提供一种能够产生聚乳酸酯或羟基链烷酸酯－乳酸酯共聚物的重组富氧罗尔斯通氏菌和使用该重组富氧罗尔斯通氏菌制备聚乳酸酯或羟基链烷酸酯－乳酸酯共聚物的方法。所述重组富氧罗尔斯通氏菌通过向其中引入将乳酸酯转化为乳酰辅酶Ａ的酶的基因和使用乳酰辅酶Ａ作为底物的聚羟基链烷酸酯（ＰＨＡ）合酶的基因来制备，可以对该重组富氧罗尔斯通氏菌进行培养，从而有效地制备乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种能够产生聚乳酸酯或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的重组富氧罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)和使用该重组富氧罗尔斯通氏菌制备聚乳酸酯或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的方法。
技术介绍
聚乳酸酯(PLA)是一种源自乳酸酯的常见生物可降解的聚合物，其非常适用于一般用途或医学聚合物的合成。目前，由微生物发酵制得的乳酸酯的聚合法是一种合成PLA 的方法。但是，这种乳酸酯的直接聚合只能制备具有低分子量(1000 5000道尔顿)的 PLA。具有100，000道尔顿或高于100，000道尔顿分子量的PLA可以使用链偶联剂由乳酸酯的直接聚合制得的较小PLA分子聚合得到。但是，该方法由于难以除去的溶剂或链偶联剂的加入而给该工艺带来了一些复杂化。最广泛使用的制备高分子量PLA的方法包括将乳酸酯转化为丙交酯和使用丙交酯环的开环加成聚合反应来合成PLA。当由乳酸酯合成PLA时，制备PLA均聚物是容易的。但是，具有多种单体组成的 PLA共聚物难以合成，且在商业上非常没有效果。聚羟基链烷酸酯(PHA)是一种在碳过量但如磷、氮、镁和氧的其它营养物缺乏时在微生物中用作能量或碳储存分子的聚酯。由于PHA与来源于石油的常规合成聚合物的相似性和其完全的生物可降解性，所以PHA被公认作为常规合成塑料的替代品。为了由微生物制备PHA，必须提供将微生物的代谢产物转化为PHA单体的酶和然后由PHA单体合成PHA聚合物的PHA合酶。为了使用微生物合成PLA和PLA共聚物，需要如上所述的体系，以及一种能够提供乳酰辅酶A(Iactyl-CoA)和羟酰辅酶A的酶，该酶最初是用于PHA合酶的底物。此外，为了经济地制备生物可降解的聚合物，在细胞中有效地累积PLA和PLA共聚物是至关重要的。特别是，需要通过高浓度培养制备高浓度的PLA和PLA共聚物。因此，需要允许有效制备适合上述条件的重组微生物的技术。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是开发一种能够产生高浓度聚乳酸酯或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的重组富氧罗尔斯通氏菌(R. eutropha)和一种使用该重组富氧罗尔斯通氏菌制备聚乳酸酯或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的方法。技术方案本专利技术的一个方面是一种能够产生高浓度聚乳酸酯聚合物或共聚物的富氧罗尔斯通氏菌重组菌株和一种使用该菌株制备聚乳酸酯或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的方法。本专利技术人成功地使用源自丙酸梭菌(Clostridium propionicum(C. propionicum))的丙酰辅酶A转移酶(其产生乳酰辅酶Α)和源自假单胞菌 6-19 (Pseudomonas sp. 6-19)的使用新合成的乳酰辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯合酶的突变体(第10-2006-0116234号韩国专利申请)来合成聚乳酸酯聚合物和共聚物。此外，为了经济地制备生物可降解的聚合物，本专利技术人想要制备能够有效产生聚乳酸酯聚合物的富氧罗尔斯通氏菌的重组菌株。为了该目的，本专利技术人制备了具有失去 PHA生产能力的重组富氧罗尔斯通氏菌，和转化的重组富氧罗尔斯通氏菌，该转化的重组富氧罗尔斯通氏菌通过如下步骤得到用表达源自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶和假单胞菌 6-19的聚羟基链烷酸酯合酶的质粒转化重组富氧罗尔斯通氏菌，或者将表达源自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的基因和表达假单胞菌6-19的聚羟基链烷酸酯合酶的基因引入到具有失去PHA生产能力的重组富氧罗尔斯通氏菌中。本专利技术人发现使用如上制得的重组富氧罗尔斯通氏菌可以由葡萄糖有效地制备聚乳酸酯聚合物和共聚物。这带来了本专利技术。有益效果 本专利技术包括一种能够有效地产生聚乳酸酯或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的富氧罗尔斯通氏菌(R.eutr0pha)的重组菌株和一种通过培养该菌株制备聚乳酸酯或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的方法。附图简述附图说明图1和2说明制备一种包含源自假单胞菌6-19的聚羟基链烷酸酯合酶的突变基因、源自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变基因和源自富氧罗尔斯通氏菌的phaAB基因的重组表达载体的过程。图3说明大肠杆菌S17-1 (Escherichia coli S17-1)与富氧罗尔斯通氏菌之间的交配和将目的基因插入到富氧罗尔斯通氏菌染色体中以制备重组富氧罗尔斯通氏菌的过程。具体实施例方式本专利技术提供一种可以产生聚乳酸酯或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的富氧罗尔斯通氏菌的重组菌株，从而去除野生型富氧罗尔斯通氏菌的聚羟基链烷酸酯(PHA)生物合成基因操纵子，并引入将外来乳酸酯转化为乳酰辅酶A的酶的基因和底物是乳酰辅酶A的 PHA合酶的基因。在本专利技术中，将乳酸酯转化为乳酰辅酶A的酶的基因可以是丙酰辅酶A转移酶 (pet)的基因。在一个具体的实施方案中，上述pet基因可以源自丙酸梭菌。 在本专利技术中，上述pet基因可以是编码具有相等或更优异的乳酰辅酶A生产活性的丙酰辅酶A转移酶的突变形式。 在一个具体的实施方案中，所述pet基因可以具有下列核苷酸序列SEQID NO 1 的核苷酸序列(cp-pct)；含有A1200G突变的SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct512)；含有 T78C、T669C、A1125G和 T1158C 突变的 SEQ ID NO :1 的核苷酸序列(cppct522)；含有 A1200G 突变的SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct531)，该核苷酸序列(cppct531)的相应氨基酸序列含有Gly335Asp突变；含有A1200G突变的SEQ ID NO 1的核苷酸序列(cppct532)，该核苷酸序列(cppct532)的相应氨基酸序列含有Ala243Thr突变；含有T669C、A1125G和 T1158C突变的SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct533)，该核苷酸序列(cppct533)的相应氨基酸序列含有Asp65Gly突变；含有A1200G突变的SEQ ID NO 1的核苷酸序列(cppct534)， 该核苷酸序列(cppct534)的相应氨基酸序列含有Asp257Asn突变；含有T669C、A1125G和 T1158C突变的SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct535)，该核苷酸序列(cppct535)的相应氨基酸序列含有Asp65Asn突变；含有T669C、A1125G和T1158C突变的SEQ ID N0:1的核苷酸序列(cppct537)，该核苷酸序列(cppct537)的相应氨基酸序列含有Thrl99Ile突变； 和含有 T78C、T669C、A1125G 和 T1158C 突变的 SEQ ID N0:1 的核苷酸序列(cppct540)，该核苷酸序列(cppct540)的相应氨基酸序列含有Vall93Ala突变。 pet基因突变体可以由第10-2007-0081855号韩国专利申请所公开的方法制备。 在一个具体的实施方案中，Pct基因优选具有含有T78C、T669C、A1125G和T1158C突变的 SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct540)，该核苷酸序列(cppct540)的相应氨基酸序列含有 Vall93Ala 突变。同时，在本专利技术中，使用乳酰辅酶A作为其底物的PHA合酶的基因可以是假单胞菌 6-19的PHA合本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种能够产生聚乳酸酯或羟基链烷酸酯－乳酸酯共聚物的重组富氧罗尔斯通氏菌（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ），其中，去除了野生型富氧罗尔斯通氏菌的聚羟基链烷酸酯（ＰＨＡ）生物合成基因操纵子，并引入了将乳酸酯转化为乳酰辅酶Ａ的酶的基因和使用乳酰辅酶Ａ作为底物的ＰＨＡ合酶的基因。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁宅镐，
申请(专利权)人：LG化学株式会社，
类型：发明
国别省市：KR
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