本发明专利技术涉及从液体富集一种目标化合物的方法，该方法包括通过在两个水相之间差别性分配进行的至少一个分离步骤。在本发明专利技术中，通过在热和其它条件下向水性生物技术溶液（例如发酵样品或生物分离过程流）中加入热致感应型自缔合（即混浊）亲水性聚合物，并且如果需要加入一些另外的盐形成这些相，其中溶液分离为一聚合物两相系统，伴随一相富集聚合物。目标化合物存在于不富集聚合物的相中，同时不同百分数但大量的杂质可差别性地分配至相界面或聚合物富集相。伴随较少改变或不改变的含目标物的相溶液可通过标准单元操作例如沉淀、色谱法和过滤得到进一步处理以进一步纯化目标物并除去任何残余的聚合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及从液体富集一种目标化合物的方法，该方法包括通过在两个水相之间差别性地分配进行的至少一个分离步骤。其看来尤其很适合于抗体或抗体衍生的目标物， 并且也可适合于其它用途如病毒疫苗处理。
技术介绍
生物技术革命，包括现代生物制药的发展和人类基因组的绘制，由于分离方法如色谱法和电泳的发展已经成为可能。这样的方法可用于小规模与大规模中，并且已知为可变方法，用于多种物质包括生物物质。然而，它们在技术和设备方面都要求高。另外，一些方法如制备型电泳的缩放由于加热和冷却需求的非线性缩放导致需要更加复杂的设备。这样的复杂化也妨碍这样的方法的模拟及其经(小体积、微量滴定)高通量筛选方法的最佳化。在聚合物水相系统中的相间分配为一种替代方法，其自20世纪50年代已得到研究，但是其商业应用受到缺乏提供良好容量(目标物溶解性)的经济上可行(廉价)相系统的严重限制。与分离方法例如絮凝、结晶和尺寸排阻一起；分配被认为是典型的分离技术。其涉及在两相之间差别性地分布目标物与其它物质。术语“分配”可指(a)液-固分配如在典型的捕获色谱法中；(b)在两个或更多个液相之间的分配(分别为双相和多相系统)；(c)在流动的液相与固定于固相载体表面的另一个液相之间分配；和(d)在液相和两相间相界面之间的颗粒分配。为了本专利申请的目的，分配(partition和partitioning) 指如b、c或d的情况即在液相之间分配。在该定义中，目标物容量也不是(固)相表面积的函数，而是液相体积的函数。因此容量可能很高(见以下)。分配通常表达为与一相中的浓度另一相中的浓度有关的系数(K)，并且对于溶质K通常遵循布朗斯台德方程式。因此预计K随着各种类型的相互作用(如静电和/或疏水相互作用)以指数方式变化，而且还对溶质大小即与液相相互作用的面积敏感。在界面分配的情况中(其中颗粒可通过界面张力保持在液-液相界面)，预计K随着界面张力以及相组成因子(phase compositional factor)而以指数方式变化。典型的液-液两相系统为有机的和水性的两相系统，其通常在相间具有显著的极性差异以及显著的界面张力。这样的系统对于生物制品如蛋白质或细胞不是很有用， 因为它们常常被显著非极性溶液和与混合具有显著界面张力的相系统有关的剪切损伤变性。对于生物制品更有用的是低张力、水性聚合物两相系统(aqueous polymer two phase-system)。已很好地认识到后者可包含一些外加的有机溶剂(例如乙醇)或其它有机添加剂，其被加入以增强目标物溶解性、减少液相极性、减少起泡、起杀菌剂作用等。聚合物两相系统可通过在水溶液中混合某些亲水性和通常为中性的聚合物形成。 这些聚合物包括葡聚糖(缩合葡萄糖)和聚乙二醇(PEG)；以及水溶性聚蔗糖(如Ficoll ) 和PEG;或者线性聚丙烯酰胺和PEG。每种聚合物的典型浓度为5-10% w/w。在这样的浓度下，熵与其它力常常驱使两相形成，这两相通常都大于90% (w/w)水，但是在极性、氢键特性、冰点等方面显示细微差异。这些相通常富集一种聚合物并具有低的界面张力。相密度差通过重力或离心驱使相分离。在生物
，PEG和葡聚糖型两相系统的一个益处是目标蛋白质可向PEG富集、不太稠密的上相分配，而细胞碎片和一些杂质可分配(或沉积) 至界面或互补的下相。独立于加入并然后从生物过程流除去两种聚合物的挑战，葡聚糖和PEG及类似的二聚合物相系统的主要缺点为聚合物的成本。这对于葡聚糖——其为本身必须被纯化以用于生物处理相系统的天然生物制品，是尤其确切的。在减少这样的成本的努力中，科学家已经研究了两种途径。第一种途径为用淀粉或其它不太昂贵的聚合物替代葡聚糖。然而这样的聚合物通常不太纯、较少控制MW、形成更加粘的相，并且伴随发生属于它们自己的独特^^占戈(Josefine Persson, Dana C. Andersen, Philip Μ. Lester, Biotechnology and Bioengineering，第90卷，(2005)442-451)。另一方法是经由混合相对高浓度的PEG(10% w/w)与盐例如硫酸钾(3%w/w)形成的两相系统起作用。关于在这样的系统中的蛋白质分配参见Andrews，Nielsen, Asenjo, 1996.和Azevedo等，2007 (在以下更详细讨论)，而对于与质粒分配相关的新近综述参见F.Rahimpour，F. Feyzi, S. Maghsoudi, R. Hatti-Kaul, Biotechnology and Bioengineering, 95，627-637，2006)。遗憾的是增加的 PEG 和盐浓度产生负面影响方法成本的挑战。这些挑战包括粘性相、盐试剂成本、盐处理和设备腐蚀挑战以及与容量相关的目标溶解性问题。例如在这些系统中的抗体容量通常为lg/L，这意指以 10g/L包含所表达抗体的(澄清)发酵液在分配之前必须稀释10倍。其也意指如果该相系统花费每升5美元来配制，那么它们增加至少1克5美元的商品成本。这样的稀释和过程体积、工艺时间和成本的相关增加是禁止性的。一些亲水性聚合物呈现反向热溶解性，这样当温度升至高于一定的混浊温度 (cloud temperature，Tc)(其与聚合物的低临界溶解温度(LCST)相关)时，它们自缔合并开始形成独特的聚合物富集相。普通文献提供了这样的聚合物的几个实例，包括用环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)单体基团的混合物形成的共聚物或嵌段共聚物(所谓的Ε0Ρ0聚合物)，用Ε0、Ρ0或类似基团修饰的多糖类(例如乙基羟乙基纤维素或EHEC)，或者采用N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAM)形成的聚合物。然而对于PEG(聚合的E0)在稀释缓冲溶液中的Tc 为约100°C，并且因此不适合于大部分生物技术应用，对于Ε0Ρ0和NIPAAM聚合物的Tc通常在更加生物技术有用的20-40°C范围内，其取决于溶液盐组成及其它因素。除了热致感应型聚合物(thermoresponsive polymer)以外，一些亲水性聚合物呈现pH依赖型自缔合 (例如 WO 2004/082801 Al)。WO 2004/020629 (Tjerneld)涉及使用 Ε0Ρ0 聚合物的反向热溶解性以进一步促进分离已经在二聚合物相系统中分配的质粒。在室温下，由Ε0Ρ0和葡聚糖聚合物形成的二聚合物两相系统以与PEG和葡聚糖系统相同的方式形成。将不太稠密的 Ε0Ρ0富集上相与Ε0Ρ0和葡聚糖水性聚合物两相系统分离。然后将Ε0Ρ0富集相的温度升至约37°C (即高于Tc)以致于该上相经进一步相分离为水富集相和自缔合Ε0Ρ0聚合物富集相。有利地，该水富集相应包含所要求的目标物。通常，这些种类的Ε0Ρ0和葡聚糖系统就相聚合物组分回收和有效二步分配分离过程的设计而论提供有利条件。然而，缺点也为与采用生物起源且昂贵的葡聚糖聚合物的系统配方有关的成本费用。不太昂贵的聚合物例如淀粉聚合物可在这样的系统中替代葡聚糖(Persson等，2005)，但是仍然存在与必须加入然后从过程流除去两种聚合物相关的挑战。在以上文献实例中，如同在普通文献中一样，相系统用于从澄清的进料纯化目标物本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．从水性液体分离至少一种目标生物分子或化合物的方法，所述方法包括：ａ．在容器中混合所述水性液体与热致感应型亲水聚合物，和如果必要时至少一种加入的盐；ｂ．在聚合物高于其浊点的条件下轻柔地混合得自（ａ）的液体混合物，以形成一聚合物两相系统，其中所述目标生物分子或化合物分配进入其中一相，并且优选该相不富集聚合物，而非目标化合物和颗粒不同程度地分配至相界面或聚合物富集相；和任选地，ｃ．通过与新的互补相混合使含目标物的相进行另一分配；ｄ．将目标生物分子从其所富集的相回收；和任选地；ｅ．从聚合物富集相将聚合物再循环回到分配单元操作。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·范阿尔斯廷，
申请(专利权)人：通用电气健康护理生物科学股份公司，
类型：发明
国别省市：SE
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