一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置及方法制造方法及图纸

一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，由探针跳跃模式扫描离子电导显微镜HPICM，以及膜片钳系统两个部分构成的装置；评估方法：得到适合于利用HPICM技术观测PC12细胞微形貌的玻璃微探针；利用HPICM技术对NGF诱导分化不同时间点的活体神经元样PC12细胞表面形貌进行扫描成像；利用HPICM系统自带的图像处理软件扫描成像进行分析；得到适合于利用膜片钳技术进行全细胞记录的玻璃微探针；利用膜片钳技术在生理条件下记录活体神经元样PC12细胞的离子通道电流；利用PC12细胞的离子通道电流计算出其对应的内向电流和电流密度。优越性：利用HPICM技术与膜片钳技术相结合的手段可操作性强，能更加准确的从结构和功能两方面来定性定量的综合分析评估PC12细胞的神经元样分化程度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于评估细胞分化程度领域，尤其是一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置及方法，特别是指从活体细胞的结构和功能两方面综合评估PC12细胞的神经元样分化，更具体的说，是基于PC12细胞在神经生长因子(NGF)持续诱导分化作用下表现出不断变化的表面微形貌及电生理特征，采用探针跳跃模式扫描离子电导显微镜技术 (HPICM)以及与其结合的膜片钳技术，通过鉴定其相应的结构和功能特征参数来评估PC12 细胞的神经元样分化程度的方法。
技术介绍
PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，与神经元细胞在发生学上均来源于神经脊，经神经生长因子(NGF)诱导分化后在结构、功能上与类交感神经元细胞有很多相似之处，又相对易于培养，实践中普遍将PC12细胞用作研究神经元的细胞模型，因此，准确鉴定 PC12细胞的神经元样分化程度对于建立良好的神经元研究模型具有基础性的重要意义。NGF诱导PC12细胞分化过程主要体现在三个方面的变化胞体微形貌的变化、神经突起的生长和电兴奋性的改变，而且这三方面的变化在神经细胞分化过程中又起到基础性作用。众所周知，在神经细胞分化过程中，离子通道对于细胞膜形貌变化和神经突起的生长起到关键性作用，其中钾离子对于神经突起的生长更为重要。另外，神经元电兴奋性取决于电压敏感性Na+、K+通道的表达和功能的发挥，其兴奋性发育的关键是河豚毒素(TTX)敏感型Na+通道，而NGF可上调PC12细胞中上述Na+、K+通道的表达。目前，常用的评估PC12细胞神经元样分化程度的方法主要有两种一、在普通光学显微镜下观察细胞胞体的变化和神经突起的生长状态，普遍认为胞体变大，神经突起数量增多、长度增加、相互交错，进而形成类神经网络结构，是PC12细胞达到高度分化的标志；但这种评估更多的借助于经验的积累，缺乏定量判断依据。二、利用膜片钳技术获得 PC12细胞表面Na+、K+通道的信息，大量试验证实神经元样PC12细胞的细胞膜上有功能性电压门控K+通道和TTX敏感型Na+通道，而且，PC12细胞经NGF作用时间越长，细胞分化程度越高，其TTX敏感型Na+电流越大。但是，只有70-80%的神经元样PC12细胞符合这种规律。因此，将两种手段结合起来，对NGF诱导分化作用下的PC12细胞胞体微形貌的变化、神经突起的生长状态和电兴奋性的改变进行定性定量的综合分析可以更加准确地评估PC12 细胞的神经元样分化程度。然而，利用普通光学显微镜观察细胞微形貌的变化和神经突起的生长状态受到光学衍射极限的限制，其分辨率有限。为了保证既能观察到活体细胞又不会损伤柔软的细胞表面以免影响后续的膜片钳实验，扫描探针显微镜(SPM)技术是很好的选择，其中，非接触式扫描离子电导显微镜(SICM)无疑比接触式的原子力显微镜(AFM)更具有优势。然而，对于连续负反馈控制模式下的SICM而言，很难对垂直高度变化比较剧烈的神经元样PC12细胞进行高分辨率地扫描成像。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从结构和功能上综合评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置及方法，它针对现阶段常用的评估PC12细胞神经元样分化程度方法的不足， 利用探针跳跃模式扫描离子电导显微镜技术(HPICM)以及与其结合的膜片钳技术在活体 PC12细胞上对其神经元样分化程度进行更加准确的评估。本专利技术的技术方案一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于它是由在生理液态培养条件下非接触式、高分辨率对活体生物样品表面微结构进行探测的探针跳跃模式扫描离子电导显微镜HPICM，以及从功能上对经NGF诱导向神经元分化的 PC12细胞电兴奋性进行评估的膜片钳系统两个部分构成的装置；所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl电极、参比Ag/AgCl电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、HPICM扫描控制系统、Z向HPICM扫描探头、XY向HPICM扫描台、膜片钳放大器、数模/模数转换器及计算机控制系统；所述充满电解液的玻璃微探针的尖端和参比Ag/AgCl电极均置于培养皿的细胞培养液中；所述充满电解液的玻璃微探针装于Z向HPICM扫描探头上；所述置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl电极分别与膜片钳放大器和HPICM扫描控制系统连接；所述参比Ag/AgCl电极与膜片钳放大器连接；所述数模/模数转换器分别于与膜片钳放大器和计算机控制系统连接；所述Z向HPICM扫描探头、XY向HPICM扫描台分别与HPICM扫描控制系统连接；所述HPICM扫描控制系统与计算机控制系统连接。所述玻璃微探针均由硼硅酸盐微电极玻璃毛细管经程控水平激光微电极拉制仪拉制而成，其中用于探针跳跃模式扫描离子电导显微镜的玻璃微探针要求尖端内壁直径 50nm,电阻 150ΜΩ ；用于膜片钳的玻璃微探针要求电阻3 6ΜΩ。所述HPICM扫描控制系统、Z向HPICM扫描探头、XY向HPICM扫描台采用英国 Ionscope公司的ICnano SICM扫描离子电导显微镜系统；所述ICnano SICM扫描离子电导显微镜系统自带的图像处理软件SICM Image Viewer装于计算机控制系统中。所述膜片钳放大器采用商用美国Axon膜片钳Multiclamp 700B放大器。所述数模/模数转换器采用美国Molecular Device公司的Digidata 1440A数模 /模数转换器。所述计算机控制系统中安装有膜片钳系统的数据采集软件；所述膜片钳系统的数据采集软件采用Clampex 10. 2数据采集及Origin 8. O分析软件。所述观测细胞表面微结构时，细胞所处的细胞培养液为L15培养基，玻璃微探针内充灌的电解液亦为L15培养基；记录离子通道电流时，细胞所处的细胞培养液是PC12细胞外液，玻璃微探针内充灌的电解液是PC12细胞内液。一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)得到适合于利用HPICM技术观测PC12细胞微形貌的玻璃微探针将由硼硅酸盐玻璃毛细管拉制的玻璃微探针内充灌L15培养基，并装于Z向HPICM扫描探头上，玻璃微探针内置有Ag/AgCl电极；玻璃微探针的尖端和参比Ag/AgCl电极浸于PC12细胞的细胞培养液L15培养基中；通过膜片钳技术测量玻璃微探针的电阻，选用阻值 150ΜΩ的微探针用于后续扫描；(2)利用HPICM技术对NGF诱导分化不同时间点的活体神经元样PC12细胞表面形貌进行扫描成像通过HPICM扫描软件设定扫描参数，以HPICM扫描控制系统监控流入玻璃微探针电流的微小变化，控制玻璃微探针的跳跃状态，记录下在各个成像点流入微探针的电流减小到设定值时微探针的位置，即为活体神经元样PC12细胞的表面三维拓扑结构；细胞的环境浴液和玻璃微探针的内液均为L15培养基；(3)利用HPICM系统自带的图像处理软件SICM Image Viewer扫描成像进行分析， 得到各个PC12细胞胞体体积Volume、细胞膜表面粗糙度RMS、细胞膜表面积kurf，然后统计分析NGF诱导分化不同时间的PC12细胞的这些形貌数据，得到NGF诱导分化不同时间的 PC12细胞胞体体积、细胞膜表面粗糙度、细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种评估ＰＣ１２细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于它是由在生理液态培养条件下非接触式、高分辨率对活体生物样品表面微结构进行探测的探针跳跃模式扫描离子电导显微镜ＨＰＩＣＭ，以及从功能上对经ＮＧＦ诱导向神经元分化的ＰＣ１２细胞电兴奋性进行评估的膜片钳系统两个部分构成的装置；所述一种评估ＰＣ１２细胞的神经元样分化程度的装置包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ａｇ／ＡｇＣｌ电极、参比Ａｇ／ＡｇＣｌ电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、ＨＰＩＣＭ扫描控制系统、Ｚ向ＨＰＩＣＭ扫描探头、ＸＹ向ＨＰＩＣＭ扫描台、膜片钳放大器、数模／模数转换器及计算机控制系统；所述充满电解液的玻璃微探针的尖端和参比Ａｇ／ＡｇＣｌ电极均置于培养皿的细胞培养液中；所述充满电解液的玻璃微探针装于Ｚ向ＨＰＩＣＭ扫描探头上；所述置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ａｇ／ＡｇＣｌ电极分别与膜片钳放大器和ＨＰＩＣＭ扫描控制系统连接；所述参比Ａｇ／ＡｇＣｌ电极与膜片钳放大器连接；所述数模／模数转换器分别于与膜片钳放大器和计算机控制系统连接；所述Ｚ向ＨＰＩＣＭ扫描探头、ＸＹ向ＨＰＩＣＭ扫描台分别与ＨＰＩＣＭ扫描控制系统连接；所述ＨＰＩＣＭ扫描控制系统与计算机控制系统连接。...

【技术特征摘要】
1.一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于它是由在生理液态培养条件下非接触式、高分辨率对活体生物样品表面微结构进行探测的探针跳跃模式扫描离子电导显微镜HPICM，以及从功能上对经NGF诱导向神经元分化的PC12细胞电兴奋性进行评估的膜片钳系统两个部分构成的装置；所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl电极、 参比Ag/AgCl电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、HPICM扫描控制系统、Z向HPICM扫描探头、XY向HPICM扫描台、膜片钳放大器、数模/模数转换器及计算机控制系统；所述充满电解液的玻璃微探针的尖端和参比Ag/AgCl电极均置于培养皿的细胞培养液中；所述充满电解液的玻璃微探针装于Z向HPICM扫描探头上；所述置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl电极分别与膜片钳放大器和HPICM扫描控制系统连接；所述参比Ag/AgCl电极与膜片钳放大器连接；所述数模/模数转换器分别于与膜片钳放大器和计算机控制系统连接；所述Z向HPICM扫描探头、XY向HPICM扫描台分别与HPICM扫描控制系统连接；所述 HPICM扫描控制系统与计算机控制系统连接。2.根据权利要求1所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于所述玻璃微探针均由硼硅酸盐微电极玻璃毛细管经程控水平激光微电极拉制仪拉制而成，其中用于探针跳跃模式扫描离子电导显微镜的玻璃微探针要求尖端内壁直径 50nm，电阻 150ΜΩ ；用于膜片钳的玻璃微探针要求电阻3 6ΜΩ。3.根据权利要求1所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于所述HPICM扫描控制系统、Z向HPICM扫描探头、XY向HPICM扫描台采用英国Ionscope公司的ICnano SICM扫描离子电导显微镜系统；所述ICnano SICM扫描离子电导显微镜系统自带的图像处理软件SICM Image Viewer装于计算机控制系统中。4.根据权利要求1所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于所述膜片钳放大器采用商用美国Axon膜片钳Multiclamp 700B放大器。5.根据权利要求1所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于所述数模/模数转换器采用美国MolecularDevice公司的Digidata 1440A数模/模数转换器ο6.根据权利要求1所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于所述计算机控制系统中安装有膜片钳系统的数据采集软件；所述膜片钳系统的数据采集软件采用Clampex 10. 2数据采集及Origin 8. O分析软件。7.根据权利要求1所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于所述观测细胞表面微结构时，细胞所处的细胞培养液为L15培养基，玻璃微探针内充灌的电解液亦为L15培养基；记录离子通道电流时，细胞所处的细胞培养液是PC12细胞外液，玻璃微探针内充灌的电解液是PCl2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彦军，刘晓，
申请(专利权)人：国家纳米技术与工程研究院，
类型：发明
国别省市：12