一种好氧反硝化耐冷菌及制备方法技术

本发明专利技术提供一种好氧反硝化耐冷菌及制备方法，其保藏号为：CGMCC?No.4753。该菌株在高溶解氧和低溶解氧水平下都能进行反硝化作用，适宜生长的温度范围较宽。接种于农田径流污染的湖水中，10℃培养7天后，硝酸根离子的去除率达80%以上，在低温期富营养化水体治理方面具有较高的价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开一种好氧反硝化耐冷菌，同时还提供了该耐冷菌的制备方法，属于水环境污染生物修复

技术介绍
我国人均水资源贫乏，而大量含氮营养盐进入湖泊和水库后易引起水体富营养化，进一步加剧了我国水资源短缺的形势，严重威胁了饮用水安全和生态系统健康。2008 年我国观个国控重点湖(库)中达到V类及以下水质的22个，占78. 6%，其中总氮为主要污染指标之一。从本质上讲，防治水体富营养化主要是解决氮磷污染问题，即减少或截断外源营养盐的输入和去除内源污染负荷。目前，主要的方法有物理方法(截污和底泥疏浚等)、化学方法(投加絮凝剂和化学药剂等)、生物方法(利用单细胞藻类、植物和微生物的生命代谢活动等)以及不同方法的联合作用。与物理法和化学法相比，生物法具有操作简便、环境扰动小、设施及其运行费用低、无二次污染、节约能源和有利于建立健康的水生生态系统等优点。单细胞藻类由于体积微小及难以收集，在富营养化治理中的应用受到一定的限制。高等水生植物在氮磷去除、重建和恢复良好水生生态系统等方面具有重要作用，但其应用往往受到季节的影响，如在东北地区，每年的有效作用时间只有4个月左右。而微生物则由于种类多、繁殖快和适应强等特点，在污染水体生物修复方面表现出了独特的作用。鉴于近几年我国北方地区的一些主要湖库均发生不同程度的水体富营养化现象， 因此研发出一种在低温期能有效去除富营养化水体中的营养盐，进而降低营养盐在水体中积累的技术对从根本上治理富营养化水体具有重要作用。研究表明耐冷菌在低温环境中可保持较高的生长和代谢活性，能有效地去除污水中的有机物和总氮。因此，研究低温期耐冷菌对富营养化水体中氮的有效去除作用，对从根本上治理我国的一些主要湖库(尤其是北方地区)的水体富营养化问题具有重要意义。在低温富营养化水体中，除微生物以外，其它生物的生命代谢活动基本停止，水体中的有机物分解速度也变慢，导致水体中的溶解氧水平比较高，因此好氧反硝化菌可以在这种环境中成为优势菌，并能通过反硝化作用，有效去除水体中的硝酸根离子。以往人们分离的好氧反硝化细菌能同时利用氧分子和硝酸根离子作为电子受体而进行反硝化过程，但反硝化速率比较慢，并且氧分子的存在对菌株利用硝酸根离子具有一定的不利影响。同时也有研究表明，在厌氧条件下微生物可在厌氧反硝化酶的催化下，以硝酸根离子为唯一电子受体进行反硝过程，但进程缓慢，反硝化效率低。
技术实现思路
本专利技术公开一种好氧反硝化耐冷菌，为一种新的菌株，通过反硝化作用，有效去除水体中的硝酸根离子。本专利技术还提供了上述菌株的制备方法，使用工业化生产。本专利技术进一步公开了该菌株在有效降低农田径流污染河水中硝酸根离子浓度的安全无污染的用途。本专利技术公开的好氧反硝化耐冷菌，命名为DBP-3，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No. 4753 ；保藏日期2011年4月7日，保藏地址北京市北辰西路1号院3号，分类命名约氏不动杆菌，AcinetcAacter Johnsonii0本专利技术所述的菌株具有以下特征(1)在牛肉膏蛋白胨平板上10°C培养3天后的菌落特征为菌落大小l_2mm，菌落呈圆形，表面光滑，淡白色，边缘整齐，透明。(2)细胞形态特征菌体短杆状，革兰氏染色阴性，菌体长约1. 4-2. 2Mffl,宽约0. 9-1. 2Mm，无芽抱，无游动。(3)约氏不动杆菌DBP-3 CGMCC No. 4753的16S rRNA基因序列特征其16S rRNA具有序列表所示的核苷酸序列，序列长度为1578 bp。参照《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)的内容，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据基于16S rRNA基因序列构建的系统发育分析，鉴定菌株(CGMCC No. 4753)为约氏 ^ ζ ΙΤlif iAcinetobacter johnsonii )。本专利技术公开的好氧反硝化耐冷菌的制备方法，包括以下步骤(1)环境温度为10-15°c时采集重度富营养化水体水样和浅水区底泥，按照体积比1:1 混合后作为菌源；(2)取20ml菌源加入到灭过菌的盛有80ml选择性培养基的250ml三角瓶中，在10°C 下，振荡培养(160r/min)培养48h，然后离心(40000r/min，15min)，取0. Olg沉淀物加入到盛满新鲜培养基的碘量瓶中静止培养，48h后离心，再取0. Olg沉淀物，加入到培养基中进行好氧培养，如此交替培养10次，每次均做3次重复和未加菌源的对照处理；(3)将最后一次的好氧培养液涂在固体培养基上培养，选取单个菌落，利用无菌水制备成每毫升含IO8-IO9个细菌的菌悬液后，取5ml加入到灭菌的盛有45ml无机盐培养基的 250ml三角瓶中，重新进行好氧培养，48小时后离心，测定上清液中的硝酸根离子浓度，选取对硝酸根离子的去除率达60%以上的菌株。对每个菌落的培养均做3次重复和不加菌体细胞的对照处理；(4)对初筛的纯菌进一步进行划线分离和无机盐营养液培养实验，最终选取能快速生长和对硝酸根离子去除率达80%以上的菌株。本专利技术菌株驯化和培养过程中所用的培养基包括选择性培养基和固体培养基，其中，选择性培养基由lg/L硝酸钾、2g/L乙酸钠、0. 125g/L磷酸二氢钾、0. 2g/L 七水硫酸镁、0. 2/L氯化钠、1.0g/L硫酸铵、0. 025g/L 二水氯化钙、3g/L叠氮化钠、0.05 mg/L硼酸、0.1 mg/L硫酸钴、0.2 mg/L硫酸铜、3 mg/L硫酸亚铁、0. 02 mg/L 二氯化锰、 0.1 mg/L 二水钼酸钠、0.03 mg/L七水硫酸锌组成，pH值为7. 2。将上述化学物质溶解于无菌水中，利用0. lmol/L的盐酸溶液和0. Imo 1/L的氢氧化钠溶液调节pH值。固体培养基由0.5 g/L牛肉膏、1.0g/L蛋白胨、0.5 g/L氯化钠、18.0 g/L琼脂组成，PH = 7.2。本专利技术的积极效果在于提供一种新的好氧反硝化耐冷菌，该菌株在高溶解氧和低溶解氧水平下都能进行高效反硝化作用，适宜生长的温度范围较宽。接种于农田径流污染的湖水中，10°c培养7天后，硝酸根离子的去除率达80%以上，在低温期富营养化水体治理方面具有较高的价值。本专利技术试图在低温条件下通过向反硝化培养基中加入细胞有氧呼吸抑制剂叠氮化钠来抑制好氧条件下菌株对氧分子的利用，从而提高对硝酸根离子的利用率，同时抑制厌氧条件下起作用的低效率反硝化酶，并且通过缺氧驯化培养，让菌株对溶解氧水平和温度变化具有较高的适应能力。目的是克服低温富营养化水体脱氮技术中的不足，提供一种利用低温定向驯化技术驯化和筛选出的对温度和溶解氧水平具有较高适应能力的好氧反硝化耐冷菌来有效降低农田径流污染河水中硝酸根离子浓度的安全无污染的方法。附图说明图1为根据16S rDNA基因序列构建的菌株PDB-3与同种属及已分离的好氧反硝化菌的系统发育树；其中*DBP-3 本专利技术所用菌株；图2为不同溶解氧条件下菌株的生长特性图； 图3为不同温度条件下菌株的反硝化能力图； 图4为菌株在富营养化水体中的反硝化能力图。具体实施例方式通过以下实施例进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术，在不背离本专利技术的技术解决方案的前提下，对本专利技术所作的本领本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．　一株好氧反硝化耐冷菌菌株，其保藏号为：ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．　４７５３。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李明堂，郝林琳，刘梦洋，曹国军，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：82