本发明专利技术提供的一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法，1）针对金黄色葡萄球菌ATCC25923的16SrRNA的片断选择靶序列，人工设计分子信标探针MB，其碱基组成为：5’-FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3’，其中5’端用FAM标记，3’端用DABCYL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm；并设计出与分子信标完全互补的寡核苷酸（P：5’-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3’）；2）通过对分子信标特性确定荧光原位杂交的温度为50℃，计算分子信标S/B值；3）用流式细胞仪进行荧光原位杂交，确定去离子甲酰胺的浓度为10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为20x105cfu/μl，分子信标的浓度为10ng/μl。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子信标，即荧光原位杂交信号经流式细胞仪高灵敏识别，直接定量检测到病人分泌物标本中低含量的金黄色葡萄球菌，同时也适用于阳性血培养物中金黄色葡萄球菌的快速定量检测。
技术介绍
目前国内外金黄色葡萄球菌的检测多采用传统的培养法以及分子生物学技术。 然而，培养法耗时长，需1-4天，不利于感染性疾病的早期诊断以及医院或社区获得性感染的预防与控制。尽管PCR方法能够快速、特异性检测金黄色葡萄球菌，但实验室扩增产物污染以及病人标本中可能存在有未知的酶抑制剂等问题难以克服，及时采用荧光原位杂交检测方法也不能直接用于分泌物标本中金黄色葡萄球菌的检测，因此，分子生物学的方法在临床试验室的应用受到一定程度的限制。分子信标(Molecular beacon,MB)由于其特异性强、灵敏度高并可在均相溶液中与靶核酸分子进行杂交等特点而在荧光原位杂交技术中得到应用M。文献检索披露PCR和FISH技术用于金黄色葡萄球菌的检测已有多篇报道，这些技术方法的建立能够对病人分泌物标本以及阳性血培养物中的金黄色葡萄球菌进行快速检测。但是PCR方法容易造成扩增产物污染，这使得金黄色葡萄球菌在临床实验室的检测受到了一定程度的限制。目前，在已报道的多种用于检测金黄色葡萄球菌的FISH技术均是采用线形探针进行杂交检测，并且所检测的标本均来源于血培养瓶中的阳性培养物。这种情况存在2个缺点一是线形探针不能用于均相溶液中靶分子的检测，因此，在杂交检测时必须进行标本的固定或者对探针进行固定，杂交反应完成后必须进行严格的冲洗以去除未杂交的探针，否则荧光背景信号高；二是病人分泌物标本中的金黄色葡萄球菌的含量低， 不能对这样的标本进行直接检测，因此，FISH的应用受到了限制。本专利技术将分子信标可在均相溶液中对靶分子进行杂交检测的特点与流式细胞仪高分辨、高灵敏度识别荧光染色细胞的特点相结合快速对病人分泌物标本及阳性血培养物中金黄色葡萄球菌进行荧光原位杂交检测。分子信标荧光原位杂交反应体系的建立首先简化了 FISH的操作步骤，无需对标本或探针进行固定，也不用对未杂交的探针进行冲洗去除，杂交检测可一步完成，最大限度地降低了干扰因素对实验的影响；其次流式细胞分析仪可以高灵敏度定量识别荧光染色的细胞，不但能直接定量检测病人分泌物标本中低含量细菌，而且能够对阳性血培养物中完整的活细胞进行定量检测，克服了目前FISH不能用于分泌物标本中低含量细菌检测的局限。本专利技术针对金黄色葡萄球菌特异性的16SrRNA片断，设计、合成分子信标探针，建立稳定的分子信标荧光原位杂交反应体系，克服了培养法耗时长以及目前分子生物学技术检测的诸多问题，为金黄色葡萄球菌感染性疾病的早期诊断以及医院或社区获得性感染的预防、控制提供新的快速检测方法
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用荧光原位杂交-流式细胞术法，建立一种快速、灵敏、特异检测病人分泌物标本以及阳性血培养物中低含量金黄色葡萄球菌的方法。本专利技术的目的是这样实现的， 包括以下步骤1)针对金黄色葡萄球菌ATCC25923的16SrRNA的片断选择靶序列，人工设计分子信标探针MB，其碱基组成为5，-FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3，；荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm;同时设计出与分子信标完全互补的寡核苷酸(P: 5’ -ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3’)；2)通过对分子信标特性确定荧光原位杂交的温度为 50°C，计算分子信标S/B值；3)用流式细胞仪进行荧光原位杂交，确定的反应体系，即去离子甲酰胺的浓度为10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为20xl05cfU/y 1，分子信标的浓度为 10 ng/μ 1。本专利技术的技术要点或原理荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)技术是一种应用非放射性荧光物质标记的核酸探针根据杂交原理检测细胞或组织内特定DNA或RNA的方法，1996年Tyagi和Kramer首次报道了一种可以实时监测PCR反应产物扩增过程的新型荧光标记探针，即分子信标，与众多用于荧光原位杂交技术的核酸探针不同的是分子信标具有独特的空间“发夹”结构，在未结合靶分子时，分子信标呈“发夹”结构，有一个环序列(loop)与一茎序列(stem)，其中环是与靶分子互补的核酸碱基序列，茎为两列与靶分子杂交无关的互补碱基序列，在探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团，当探针处于完整的“发夹”结构时，荧光基团和淬灭基团由于茎序列的互补结合而彼此紧密相邻，从而产生荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)效应，导致荧光信号被有效淬灭而不能释放出来，当探针与互补的靶分子结合时，分子信标的“发夹”结构被打开，荧光基团和淬灭基团彼此分离，荧光信号不能被淬灭而得以释放，本专利技术中流式细胞仪能够检测到杂交后的荧光信号，从而检测到金黄色葡萄球菌，彰显技术进步。附图说明本专利技术对照附图作进一步的阐明附图为分子信标热变性曲线如图所示上曲线为分子信标与完全互补的寡核苷酸杂交曲线，对应荧光强度值即F open;中间曲线为分子信标随温度变化的曲线，对应荧光强度值即F closed;下曲线为缓冲液随温度变化的曲线，对应荧光强度值即F buffer.具体实施方式实施例(1)分子信标及寡核苷酸序列的设计与合成针对金黄色葡萄球菌ATCC25923的16S rRNA序列，设计出能特异地检测金黄色葡萄球菌的分子信标(5’ -FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3’ )及与其完全互补的寡核苷酸 (P :5，-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3，)。 (2)通过对分子信标做热变性曲线实验，确定荧光原位杂交的最佳温度为5(TC， 计算分子信标 S/B (Signal-to-background ratio，S/B)值S/B =(F open-F buffer)/(F closed—F buffer)；用流式豳进行荧*原位杂交.病定纖_反应体系；用正交设W敦件擴斜:20%,:.i\ M4i“ M Wta IC !Π,, :ι-Γ,,Μλ Ι) IiHfiΙ'βΛ .j—二——I‘f-10 -Vif-(3)选择出能特异性地检测金黄色葡萄球菌的靶序列，在该段靶序列上用beacon designer〗· 1软件设计与其完全互补的分子信标探针(5，-FAM_cgctgaAGAAGCAAGCTTCTCGTC CGTtcagcg-DABCYL-3')，该分子信标是由碱基组成的颈环结构的特异序列，其中5，端用FAM 标记，3，端用DABCTL标记，荧光基团要求激发波长495nm，检测波长520nm ；人工设计合成分子信标及与其完全互补的寡核苷酸。 (4) 3种溶液在PCR反应管中配制后置于荧光定量PCR仪中，温度从80°C下降到530°C，温度每降低1°C采集一次荧光；将3种溶液从80°C下降到30°C的荧光强度做散点图即为MB的热变性曲线；从热变性曲线图看出，温度在45-55°C内时，MB与完全互补的寡核苷酸杂交稳定，荧光强度较高；MB随温度降低，曲线较平缓，说明荧光强度较稳定；当温本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：１）针对金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ２５９２３的１６ＳｒＲＮＡ的片断选择靶序列，人工设计分子信标探针ＭＢ，其碱基组成为：５’－ＦＡＭ－ＡＣＧＧＡＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴ －ＤＡＢＣＹＬ－３’，其中５’端用ＦＡＭ标记，３’端用ＤＡＢＣＹＬ标记，荧光基团激发波长４９５ｎｍ，检测波长５２０ｎｍ；并设计出与分子信标完全互补的寡核苷酸（Ｐ：５’－ＡＣＧＧＡＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴ－３’）；２）通过对分子信标特性确定荧光原位杂交的温度为５０℃，计算分子信标Ｓ／Ｂ值；３）用流式细胞仪进行荧光原位杂交，确定去离子甲酰胺的浓度为１０％，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为２０ｘ１０５ｃｆｕ／μｌ，分子信标的浓度为１０ ｎｇ／μｌ；其中将金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ２５９２３接种于哥伦比亚血琼脂平板培养，挑取对数生长期的菌落，用无菌的２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ７．２缓冲液调至２０ｘ１０５ｃｆｕ／μｌ浓度；其１菌体制备：吸取２０ｘ１０５ｃｆｕ／μｌ的金黄色葡萄球菌２ｍｌ，１００００ ｒｐｍ离心５ ｍｉｎ，收集菌体；加入６ｍｌ固定液，固定液为４％多聚甲醛＋９６％ ２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ７．２；４ ℃固定１ｈ；离心１００００ ｒｐｍ，５ ｍｉｎ，除去残留的多聚甲醛；用２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ７．２缓冲液洗涤１次，得菌体沉淀物； 其２酶处理：向上述的菌体沉淀物中加入１ｍｇ／ｍｌ溶葡萄球菌酶１００ μｌ，３７℃，１５ ｍｉｎ；收集菌体１００００ ｒｐｍ，５ ｍｉｎ；分别用５０％、８０％、９５％乙醇脱水３ｍｉｎ；用２０ μｌ ２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液重悬菌体，平均加入２个管中备用； 其３配制杂交缓冲液：在ＥＰ管中加入１０μｌ１００ ｎｇ／μｌ的ＭＢ和１０μｌ１００％的去离子甲酰胺后，用２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ补足至１００μｌ；对照缓冲液：在ＥＰ管中加入１０μｌ１００％的去离子甲酰胺后，用２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液补足至１００μｌ，备用； 其４杂交：经酶处理的产物一管作为阳性，加入１００μｌ杂交缓冲液；另一管作为阴性对照，加入１００μｌ阴性对照缓冲液；２个管置于５０ ℃，避光杂交２ｈ，２个管分别收集菌体１００００ ｒｐｍ，５ ｍｉｎ；２个管分别加入不含探针的１００ μｌ缓冲液，于４８ ℃洗涤１５ｍｉｎ；２个管分别重悬于５００μｌ缓冲液中，置于冰上，３ｈ内取样，过滤后测定。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张新，马集云，吴良，苗书魁，唐金路，陈旭，鹿新红，
申请(专利权)人：新疆生产建设兵团医院，
类型：发明
国别省市：65
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