本发明专利技术公开了一种分离回收氯过氧化物酶(Chloroperoxidase，EC?1.11.1.10，CPO)的方法，利用共沉复溶法，即亲水性高分子聚乙二醇在高盐浓度下沉淀夹带CPO分子，从而富集CPO蛋白浓度，再运用双水相萃取技术高效分离回收高纯度CPO，即利用分离目标产物和杂质在亲水性高分子相溶液中分配系数不同而对不同蛋白质加以分离。本发明专利技术通过研究提出合理可行的双水相CPO提取纯化条件，总结微小含量生物活性物质的分离技术，解决或改善了目前CPO生产过程存在的提取干扰大、回收率低、产品价格高、提纯周期长、不能规模化生产等问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及。
技术介绍
氯过氧化物酶(Chloroperoxidase, EC 1. 11. 1. 10，CP0)分子为一种血红素糖蛋白，其辅基是高铁(IX)原卟啉，它的许多光谱学和化学性质都与细胞色素P-450高度相似， 而过氧化物酶本身又具有类似过氧化氢酶的结合位点，因此，CPO具有较为广泛的底物适应性，可以催化多种物质进行过氧化反应，如能够催化卤素离子、芳香族化合物、脂肪族化合物和醇类化合物等进行过氧化反应。目前，CPO已经被应用到多种手性化合物合成和药物生产中，以减少反应过程中手性异构体的损失，去除药物手性对映体的毒性，减轻废弃物对环境的污染等，是一种十分有应用前景的“手性生物催化剂”。海洋真菌Caldariomycesfumago是目前发酵生产CPO的主要菌种，但是，发酵液中 CPO的浓度积累却很低(一般小于100mg/L)，酶活性稳定性也较差，传统的CPO提纯方法的酶回收率普遍低下，这是造成CPO生产成本居高不下的主要原因，严重限制了 CPO的开发与使用。现有技术中，CPO的提纯都是采用传统盐析加层析的操作方法，利用蛋白质的可逆沉淀反应---蛋白质的盐析作用，用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出。蛋白质是亲水胶体，在中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。沉出的蛋白质仍保持其天然蛋白的性质，因此，降低盐的浓度时，还能溶解。沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度不同，而盐类不同也有差异。氯过氧化物酶的盐析一般用硫酸铵。通常，为获得高纯度CP0，往往需要综合利用目标产物的理化特性，采用多种分离技术组合，以往的CPO提纯过程中，由于目标蛋白浓度极低，发酵液组成复杂，细胞代谢物含量大，除杂、提取纯化工序复杂，环节繁多，最终层析纯化产品的得率一般低于6%。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述现有技术的不足，提出一种分离回收氯过氧化酶的方法。本专利技术的技术方案如下，包括如下步骤(1) CPO发酵液的制备将海洋真菌菌苔接入发酵培养基，25 33°C下发酵6 8d 得CPO发酵液；(2) CPO发酵液的预处理将CPO发酵液在4-10°C的条件下离心，或者采用真空抽滤去除菌丝以及其它固形物，收集含黑色素的清液，所得清液在冰浴条件下缓慢加入聚合度4000 6000的PEG并不断搅拌混合，静置待PEG与黑色素絮凝稳定后在4 10°C下离心，收集黄绿色的脱色液，用稀磷酸调节PH至4-6 ；(3)CPO与PEG的共沉淀在冰浴条件下，向上述脱色液中边搅拌边缓慢加入固体 (NH4)2SO4至沉淀开始出现，4-10°C下静置8-10h，抽滤得淡黄色复合沉淀物；(4)沉淀物的复溶解用磷酸盐缓冲液溶解步骤( 所得沉淀物至形成上下相体积比为1/5 1/4的双水相体系，上层水相富含PEG，下层水相富含(NH4)2SO4，萃取分离两相；所述的磷酸盐缓冲溶液PH4 6 ；与沉淀物的质量比为30% 40%，优选为35% ；(5)CP0凝胶层析纯化将步骤(4)所得的下层酶液用pH值为4_6的磷酸盐缓冲液透析至无硫酸根离子，埋入经过干燥的PEG固体粉末中吸水浓缩到透析后体积的1/5 1/4，上层析柱纯化；收集酶活与Rz值大于1. 2的收集液合并，再经真空冷冻干燥浓缩，得氯过氧化物酶，Rz = A4Q3/A28Q，其中A4tl3为血红素辅基在403nm处的光吸收值；A28(1为蛋白质在 ^Onm处的光吸收值。本专利技术中所述PEG优选聚合度为6000的PEG;步骤O)中所述PEG与所述清液质量比为4% 8%，优选为6%。本专利技术通过研究提出合理可行的双水相CPO提取纯化条件，总结微小含量生物活性物质的分离技术，提出，比常规盐析-层析法提纯周期明显缩短，回收率远大于盐析作用，且对初始发酵液的体积要求小，解决或改善了目前 CPO生产过程存在的提取干扰大、回收率低、产品价格高、提纯周期长、不能规模化生产等问题。附图说明图1为PEG聚合度对沉淀CPO回收率的影响。图2为PEG6000添加量对CPO共沉淀回收的影响。图3为PBS添加量对CPO双水相组成、CPO分配系数及得率的影响。图4为PBS的pH对CPO在双水相中分配系数及酶得率的影响。图5为CPO复溶提纯液层析洗脱曲线。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例应理解为仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的保护范围。在阅读了本专利技术记载的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本专利技术权利要求所限定的范围。实施例1 (I)CPO发酵液的制备将PDA平板上培养IOd的Caldariomyces fumago菌苔按2cm2菌苔/250mL三角瓶的接种量接入为发酵培养基(包含g/L 麦芽糖40、NaNO3 2，KC12，KH2PO4 2，MgSO4 · 7H20 0. 5，FeSO4 · 7H20 0. 02，CaCl2 0. 09，另加体积比为20%的马铃薯浸出液，初始pH为7.0)， 摇瓶装液量50ml/250mL三角瓶，发酵温度25°C、摇床转速MOr/min，发酵6d。(2) CPO发酵液的预处理发酵液在4000g，10°C的条件下离心lOmin，或者采用真空抽滤去除菌丝以及其它固形物，收集含黑色素的清液，清液在冰浴条件下缓慢加入质量为该清液质量的6%的PEG400并不断搅拌混合，静置4h待PEG与黑色素絮凝稳定后离心(6000 X g，4°C，IOmin)， 收集黄绿色的脱色液，用0. 2mol/L稀磷酸调节pH至5. 8。(3) CPO与PEG的共沉淀在冰浴条件下，向脱色液中缓慢加入固体^扎)2504至60%饱和度。过程中不断搅拌，防止局部盐浓度过高而造成酶的失活。待沉淀开始出现后4°C下静置他，抽滤得淡黄色复合沉淀物；(4)分别考察沉淀物与残留液的总酶活。结果显示沉淀物总酶活为原液总酶活的35%，残留液总酶活为原液总酶活的 63%,总酶活损失1 %。说明使用PEG400对CPO的回收效果不好。实施例2:过程与实施例1相同，不同之处在于步骤(2)使用PEG800。结果显示沉淀物总酶活为原液总酶活的60%，残留液总酶活为原液总酶活的 36%,总酶活损失4%。说明使用PEG800对CPO的回收效果仍不理想，但较使用PEG400有明显改善。实施例3 过程与实施例1相同，不同之处在于步骤(2)使用PEG4000。结果显示沉淀物总酶活为原液总酶活的78%，残留液总酶活为原液总酶活的 18%,总酶活损失4%。说明使用PEG4000对CPO的回收效果较好，但总酶活损失较大。实施例4 过程与实施例1相同，不同之处在于步骤(2)使用PEG6000。结果显示沉淀物总酶活为原液总酶活的95%，残留液总酶活为原液总酶活的 4 %，总酶活损失1 %。说明使用PEG6000对CPO的回收效果理想，总酶活损失也较小。实施例5过程与实施例4相同，不同之处在于步骤(2)使用的PEG6000质量为O。结果显示沉淀物总酶活为原液总酶活的对％，残留液总酶活为原液总酶活的 76%，总酶活损失O%。较使用清液质量6%的PEG6000对CPO的回收效果相差巨大。实施例6过程与实施例4相同本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种分离回收氯过氧化物酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：（１）ＣＰＯ发酵液的制备：将海洋真菌菌苔接入发酵培养基，２５～３３℃下发酵６～８ｄ得ＣＰＯ发酵液；（２）ＣＰＯ发酵液的预处理：将ＣＰＯ发酵液在４－１０℃的条件下离心，或者采用真空抽滤去除菌丝以及其它固形物，收集含黑色素的清液，所得清液在冰浴条件下缓慢加入聚合度４０００～６０００的ＰＥＧ并不断搅拌混合，静置待ＰＥＧ与黑色素絮凝稳定后在４～１０℃下离心，收集黄绿色的脱色液，用稀磷酸调节ｐＨ至４－６；（３）ＣＰＯ与ＰＥＧ的共沉淀：在冰浴条件下，向上述脱色液中边搅拌边缓慢加入固体（ＮＨ４）２ＳＯ４至沉淀开始出现，４－１０℃下静置８－１０ｈ，抽滤得淡黄色复合沉淀物；（４）沉淀物的复溶解：用磷酸盐缓冲液溶解步骤（３）所得沉淀物至形成上下相体积比为１／５～１／４的双水相体系，上层水相富含ＰＥＧ，下层水相富含（ＮＨ４）２ＳＯ４，萃取分离两相；所述的磷酸盐缓冲溶液ｐＨ４～６；（５）ＣＰＯ凝胶层析纯化：将步骤（４）所得的下层酶液用ｐＨ值为４－６的磷酸盐缓冲液透析至无硫酸根离子，埋入经过干燥的ＰＥＧ固体粉末中吸水浓缩到透析后体积的１／５～１／４，上层析柱纯化；收集含高组分酶活的洗脱液，测定其ＲＺ值，将ＲＺ值大于１．２的收集液合并，再经真空冷冻干燥浓缩，得氯过氧化物酶，ＲＺ＝Ａ４０３／Ａ２８０，其中Ａ４０３为血红素辅基在４０３ｎｍ处的光吸收值，Ａ２８０为蛋白质在２８０ｎｍ处的光吸收值。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈军，许甜甜，张书翠，诸葛俊贵，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：31
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