一种测定三聚氰胺含量的非标记电化学免疫传感器及其制备方法和应用。所述的免疫传感器，包括基底电极，基底电极表面修饰石墨烯-三聚氰胺-壳聚糖复合物，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。其制备方法是以石墨烯/壳聚糖复合材料固定三聚氰胺抗原于玻碳电极表面。所述的免疫传感器基于免疫反应的竞争模式，利用K3Fe(CN)6为探针，以循环伏安法和差分脉冲伏安法监测免疫反应，可用于三聚氰胺含量的检测。本发明专利技术的传感器具有较高的灵敏度和专一性，检测方法简单，适用范围广泛，检测限可达到0.2ng/ml，线性范围5~1500ng/ml，具有快速高效、灵敏度高和特异性好、操作简单、成本低等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品安全检测和分析化学
，涉及一种三聚氰胺的检测装置和方法，具体地说是一种应用于测定食品和饲料中违禁添加物三聚氰胺的电化学免疫传感器及其制备方法，以及利用该传感器定量检测三聚氰胺含量的方法。
技术介绍
三聚氰胺(Melamine)是一种重要的化工原料，常用于制造防火阻燃材料三聚氰胺树脂，也可用作减水剂和甲醛清洁剂等，在部分亚洲国家，还被用来制造化肥。由于牛奶和饲料工业常用的蛋白质含量检测方法“凯氏定氮法”，是通过测定含氮量来估算蛋白质含量，要求蛋白质平均含氮量为16 %左右，而三聚氰胺的含氮量约为66 %，因此三聚氰胺常被不法商人用作添加剂，以提升牛奶和饲料中的蛋白质含量指标，使劣质牛奶和饲料通过检验机构的检测。研究表明，三聚氰胺能诱发动物肾衰竭并导致死亡。三聚氰胺在体内的代谢属于不活泼代谢或惰性代谢，即它在体内不会迅速发生任何类型的代谢变化。单胃动物以原体形式或同系物形式排出三聚氰胺，而不是代谢产物的形式。2008年发生的三聚氰胺毒奶粉事件，使得分析化学领域掀起了研究三聚氰胺检测方法的热潮，国内外开始对三聚氰胺及其检测产生高度关注。三聚氰胺的传统检测方法有重量法、升华法等，但只限于对三聚氰胺原料的检测。 近几年发展起来的方法有高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法、气相色谱质谱联用法、酶联免疫吸附法等。但是这些分析方法需要大型分析仪器，操作过程繁琐，前处理过程复杂， 不能实现现场检测。三聚氰胺的检测的方法中还包括电化学检测方法，如CN20102(^99766. 1公开了一种用于快速检测三聚氰胺的修饰电极，包括基底电极；设置于基底电极外表面的PDDA 膜；以及设置于PDDA膜外表面的FDU膜。CN201010235974. X公开了一种用于三聚氰胺检测的碳纳米管修饰电极制备方法，将碳纳米管分散在DMF、四氢呋喃、甲醇、乙醇、水等溶剂中，再将此纳米管溶液和壳聚糖、Nafion、聚乙烯醇等粘合剂混合，分散均勻后将其涂在电极表面制成碳纳米管修饰电极。该电极能够检测三聚氰胺，最低检测限为10-13mol/L。 CN200810234859. 3披露了一种奶制品中三聚氰胺的电化学快速检测方法，其特征在于采用电化学法，以含碳的材料作为工作电极，将奶制品溶于酸性电解质溶液中，在较正的电位下作循环伏安扫描电解1 10分钟，根据所制得的伏安曲线，对奶制品中是否含有三聚氰胺进行初步定性分析和定量分析。所述检测方法，在灵敏度和特异性方面还有待进一步提高。自上世纪80年代以来，生物传感器的研究与开发呈现出突飞猛进的局面，各类传感器应运而生。其中，与测定抗原抗体反应有关的传感器称为免疫传感器。抗原抗体结合前后可导致多种信号的改变，如在重量、光学、热学、电化学等方面。免疫传感器在检测三聚氰胺上已得到广泛应用，如各种基于抗体和抗原反应的用于三聚氰胺检测的免疫试剂(盒)。由于电化学分析具有的以下特点和优势，如可以实现在体检测，不受样品颜色、浊度的影响(即样品可以不经处理，不需分离)，且所需仪器设备相对简单，因此应用前景看好。本专利技术旨在通过一种三聚氰胺检测的直接电化学生物免疫传感器的制备，建立一种检出限低、线性范围宽、灵敏度和特异性高、快速现场测定三聚氰胺含量的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种电化学免疫传感器及其制备方法，所述的传感器具有很高的灵敏度和专一性，可用于三聚氰胺检测。本专利技术的另一目的还在于提供一种简单、快速、高效测定牛奶等食品中违禁添加物三聚氰胺残留量的检测方法。实现本专利技术目的采用的技术方案如下一种检测三聚氰胺的电化学免疫传感器，包括基底电极，其特征在于所述的基底电极表面修饰石墨烯-三聚氰胺-壳聚糖复合物，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。所述的基底电极优选玻碳电极。本专利技术的另一目的是提供一种所述免疫传感器的制备方法，技术方案如下一种检测三聚氰胺的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于将石墨烯的壳聚糖悬浮液超声分散后与三聚氰胺混合，将混合液滴涂在电极表面，利用壳聚糖将石墨烯和三聚氰胺包被并固定于电极表面，并将电极浸泡在牛血清蛋白(BSA)溶液中，封闭电极表面的非特异性的活性位点。所述的基底电极优选玻碳电极。所述的免疫传感器的制备，更具体和更优选的方法包括如下步骤1)石墨烯-壳聚糖悬浮液的配制将0.05M的HCl加热至80 90°C，加入称量好的壳聚糖，搅拌溶解，冷却后加入浓度为0. IM的NaOH，调节pH至5，配得lmg/mL的壳聚糖溶液；准确称取5g石墨烯样品于2mL壳聚糖溶液中，超声分散lh，制得石墨烯-壳聚糖悬浮液；2)玻碳电极处理直径为3mm的玻碳电极用分别用1.0和0. 3Mm的Al2O3粉乳液打磨抛光后，分别在乙醇和水中各超声清洗:3min ；3)电极表面修饰将4μ L石墨烯-壳聚糖悬浮液与2 μ L浓度为0. 2mg/mL的三聚氰胺水溶液混合，滴涂于步骤2)制得的玻碳电极表面，40°C下烘干30min ；4)非特异性的活性位点封闭表面修饰后的电极于37°C下浸泡在5%的BSA溶液中 30min，以封闭剩余的活性位点，制得所述的电化学免疫传感器。所述的石墨烯的制备，可以氧化石墨(GO)作为前驱体，通过氧化石墨的还原和石墨烯的功能化得到性能优异的石墨烯。上述免疫传感器可用于测定三聚氰胺的含量。电极在含有三聚氰胺抗体和游离的己烯雌酚的溶液中孵育时，溶液中游离的三聚氰胺和固定在电极表面的三聚氰胺与溶液中三聚氰胺抗体发生竞争性免疫反应，三聚氰胺抗体与电极表面固定的三聚氰胺反应后， 抗体吸附在电极表面。游离的三聚氰胺浓度越高，固定在电极上的三聚氰胺结合的抗体越少。WK3Fe(CN)6为探针，进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，抗体在电极表面的吸附，会使 !^e (CN)63_Λ_氧化还原峰电流值降低。因此利用竞争性免疫反应机制，不同浓度的三聚氰胺孵育后的电极，在1(3狗(0幻6溶液中差分脉冲伏安法(DPV)得到的曲线峰电流不同。实验结果显示，随着三聚氰胺浓度在孵育液中的增加，DPV峰电流增大，且峰电流增大值与三聚氰胺浓度呈线性，从而实现对三聚氰胺的定量检测。因此，本专利技术还涉及一种基于所述的免疫传感器检测三聚氰胺的方法，包括以下步骤1)标准溶液配制配制一组包括空白标样在内的含有不同浓度游离三聚氰胺的PH为 7. 4的磷酸缓冲溶液为标准溶液，其中含有相同浓度的三聚氰胺抗体；2)建立工作曲线将免疫传感器分别浸入标准溶液中孵育，孵育后用磷酸缓冲溶液冲洗免疫传感器，在K3溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，记录响应电流；空白标样的响应电流为Ici,含有游离三聚氰胺的标样的响应电流为Ix，响应电流的增加Δ I (Δ I=Ix-I0)与标准溶液中三聚氰胺浓度C成正比，绘制Δ I-C标准曲线，或采用线性回归法得到Δ I-C线性回归方程；3)三聚氰胺测定将待测样品配制为含有与步骤1)相同浓度三聚氰胺抗体的磷酸缓冲溶液，按照与步骤2)相同的方法对免疫传感器进行孵育和差分脉冲伏安扫描，记录响应电流；根据响应电流的增加Δ I和标准曲线，得到三聚氰胺含量。所述的KJFe(CN)6]溶液的浓度优选为2 mM。免疫反应条件优选在37°C下孵育60 min。所述的三聚氰胺抗体的浓度优选4 μ g/mL。所述的步骤本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测三聚氰胺的电化学免疫传感器，包括基底电极，其特征在于所述的基底电极表面修饰石墨烯－三聚氰胺－壳聚糖复合物，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵波，陈昌云，邵科峰，颜妍，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：84
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