【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用生物转化将木犀草素转化为四种黄酮化合物的方法，尤其涉及一种以木犀草素为原料微生物转化为木犀草苷、木犀草素-4'-o-葡萄糖苷、木犀草素-7-o-β-(6”-o-琥珀酰)-d-葡萄糖苷和木犀草素-4'-o-β-(6”-o-琥珀酰)-d-葡萄糖苷的方法，属于生物化工。
技术介绍
1、木犀草苷(luteoloside)，又名木犀草素-7-o-葡萄糖苷(luteolin-7-o-glucoside)，是植物中广泛存在的一种化合物。研究发现木犀草苷具有相对较弱的抗新型冠状病毒及其变异株的药理活性，另外，木犀草苷因其邻二酚羟基结构，具有较强的杀菌消炎，解热镇痛的功效，还有抗病毒、抗肿瘤、抗呼吸道病毒等作用。
2、木犀草素-4'-o-葡萄糖苷是木犀草苷的同分异构体，常见于一些植物如火绒草科植物、木犀属植物等。木犀草素-4'-o-葡萄糖苷在植物中具有一定的生理活性和药用价值，具有抗高尿酸血症、急性痛风性关节炎活性和抗癌活性等。木犀草素-4'-o-葡萄糖苷还具有很强的抗氧化活性，且接近于维生素c，其表现出有效的dpph自由基清除活性和浓度依赖性的还原力。
3、在0.1％dmso中木犀草素和木犀草苷对k562细胞增殖均可表现出抑制作用，且呈浓度依赖性；木犀草苷的作用比木犀草素强(李惠香,张倩,柳亚男等.木犀草素与木犀草苷的抗炎活性对比研究[j].烟台大学学报(自然科学与工程版),2018,31(2):114-120)。武毅君等通过研究木犀草素和木犀草苷在羟丙基纤维素中的释放行为探索亲水凝胶中药物缓释的理
4、白细胞介素(il)-5是嗜酸性粒细胞的趋化因子，促进嗜酸性粒细胞的生长和存活，在嗜酸性粒细胞增多相关性过敏性炎症中起重要作用。在这项研究中，木犀草素-4'-o-吡喃葡萄糖苷被鉴定为来自kummerowia striata thunb的il-5抑制剂。黄酮化合物对il-5生物活性表现出剂量依赖性抑制作用，从ic50值来看，对il-5生物活性的抑制由大到小依次为木犀草素-4'-o-吡喃葡萄糖苷>芹菜素(14.2μm)与木犀草素(16.4μm)>槲皮素(18.7μm)与山奈酚(27.3μm)(keun,yeong,park,et al.inhibitory effect of luteolin4-o-glucoside from kummerowia striata and other flavonoids on interleukin-5bioactivity[j].planta medica,1999)，可见木犀草素-4'-o-葡萄糖苷的生物活性比木犀草素强。
5、木犀草苷主要存在于唇形科植物青兰叶，荆芥的干燥地上部分；豆科植物狭叶槐叶，鸡眼草全草；菊科植物洋蓟叶；忍冬科植物忍冬；蔷薇科植物日本龙牙草茎叶(管仁伟,曲永胜,顾正位等.木犀草苷的药理作用研究[j].中国野生植物资源,2014,33(01):1-3)。木犀草苷在毛连菜叶、紫苏子、苦荬菜、忍冬叶中木犀草苷量较低(叶方,张慧莹,王雪芹等.毛连菜不同生长部位的活性成分含量比较[j].医药导报,2023,42(5):708-711)(权勤波,宋建建,陈淑梅等.hplc法同时测定迷迭香酸、芹菜素和木犀草苷的含量[j].药学研究,2021,40(6):380-382；曾文辉,龚千锋,廖宝源.高效液相色谱法测定苦荬菜中木犀草苷和菊苣酸的含量[j].药品评价,2021,18(02):68-70；马子力,黄兴龙,冯剑英等.黔产忍冬叶中木犀草苷含量测定[j].贵州科学,2020,38(02):1-4)。在金银花中含量0.9mg/g(王柯,王艳艳,赵东保等.hplc法测定金银花不同部位中木犀草素及其苷的含量[j].河南大学学报(自然科学版),2011,41(1):39-43)，金银花价格高，生物量小，资源有限。
6、木犀草苷的研究大多集中在提取、纯化及药理活性等方面，目前主要从植物中提取但因含量低导致成本高昂，寻找木犀草苷的其他来源是具有重要的应用价值。
7、jae k h等采用pcr方法克隆蜡样芽孢杆菌udp-糖基转移酶bcgt-1基因并进行了测序。bcgt-1在大肠杆菌bl21(de3)中表达，并用his-tag亲和柱纯化。bcgt-1可以芹菜素、染料木素、山奈酚、木犀草素、柚皮素和槲皮素为底物，得到两种反应产物。该酶优先在3-羟基上进行糖基化，但当3-羟基不存在时，可以将一个葡萄糖基转移到7-羟基上。与表达bcgt-1的大肠杆菌生物转化的反应产物与纯化的重组酶的反应产物相似(jae h k,bong gk,ahn j h.glycosylation of flavonoids with a glycosyltransferase frombacillus cereus[j].fems microbiology letters,2006(2):263-268)。此方法需要复杂的基因克隆，步骤繁琐，木犀草素转化率为40.9％。
8、刑有权等以橙皮苷为原料通过化学合成得到木犀草苷，从橙皮苷制备木犀草素的收率为35％，从木犀草素制备木犀草苷的收率为16.8％。以橙皮苷计合计总收率为5.88％，步骤多，产率低，成本高(刑有权，孙志忠，韩文辉，韩晓玲.木犀草素及葡萄糖苷的半合成[j].中国医药工业杂志,1994,25(11):484-487)。
9、闻永举等将吡啶类、三价铝离子化合物、低沸点的醇、橙皮素-7-o-葡萄糖苷、碘混合，在室温-110℃反应脱氢，形成均一液，pc/tlc/hplc跟踪起始产物脱氢完全。然后在80℃-180℃密闭蒸馏2h-80h，pc/tlc/hplc跟踪检查脱甲基产物，将蒸馏产物加醇加热溶解，加入磷酸，析出木犀草苷和香叶木素-7-o-葡萄糖苷，经层析分离得到木犀草苷和香叶木素-7-o-葡萄糖苷，木犀草苷得率为64.7％(闻永举,申秀丽,张洁.木犀草素、木犀草苷、木犀草素芸香糖苷半合成的方法[p].cn103833714b)。因此化学合成步骤繁多，产率极低、环境污染大。
10、柚皮素通过解淀粉芽孢杆菌fj18的转化作用可得到柚皮素-7-o-葡萄糖苷-6”-琥珀酸酯(陶伟伟,段金廒,张森.一种柚皮素-7-o-葡萄糖苷-6”-琥珀酸酯及其在制备抗菌或治疗骨质疏松药物方面的应用[p].cn107857786b)，但同时生物合成木犀草素-7-o-葡萄糖苷-6”-琥珀酸酯和木犀草素-4'-o-β-(6”-o-琥珀酰)-d-葡萄糖苷的微生物和转化方法还有待于找寻。
11、本专利技术通过大量的菌种选育和创造性的工作，提供了一种利用生物转化生成木犀草苷、木犀草素-4'-o-葡萄糖苷、木犀草素-7-o-β-(6”-o-琥珀酰)-d-葡萄糖苷和木犀草本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用生物转化将木犀草素转化为四种黄酮化合物的方法，其特征在于，所述方法包括将木犀草素底物加入到产糖基转移酶或琥珀酰基加合酶的微生物中，加入糖基供体，经生物转化，柱层析分离纯化，得到四种黄酮化合物。
2.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述糖基转移酶为环糊精β-葡萄糖基转移酶，所述糖基供体为糊精、乳糖、蔗糖、环糊精或麦芽糖。
3.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述四种黄酮化合物为木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-4'-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-(6”-O-琥珀酰)-D-葡萄糖苷和木犀草素-4'-O-β-(6”-O-琥珀酰)-D-葡萄糖苷。
4.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述木犀草素底物为木犀草素溶液或含木犀草素的植物的提取液。
5.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述微生物为芽孢杆菌、乳杆菌或重组大肠杆菌中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的转化方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为浸麻类芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、软化类芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、
7.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，产糖基转移酶和琥珀酰基加合酶的微生物的加入形式为产糖基转移酶和琥珀酰基加合酶的微生物菌株、微生物菌液、微生物菌粉、微生物提取的酶液或微生物提取的酶粉。
8.根据权利要求1-7任一项所述的转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在5-55℃转化2-48h，得到木犀草素-7-O-葡萄糖苷和木犀草素-4'-O-葡萄糖苷。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在5-55℃继续转化2-48h，木犀草素-7-O-葡萄糖苷转化为木犀草素-7-O-β-(6”-O-琥珀酰)-D-葡萄糖苷，木犀草素-4'-O-葡萄糖苷转化为木犀草素-4'-O-β-(6”-O-琥珀酰)-D-葡萄糖苷。
...【技术特征摘要】
1.一种利用生物转化将木犀草素转化为四种黄酮化合物的方法，其特征在于，所述方法包括将木犀草素底物加入到产糖基转移酶或琥珀酰基加合酶的微生物中，加入糖基供体，经生物转化，柱层析分离纯化，得到四种黄酮化合物。
2.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述糖基转移酶为环糊精β-葡萄糖基转移酶，所述糖基供体为糊精、乳糖、蔗糖、环糊精或麦芽糖。
3.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述四种黄酮化合物为木犀草素-7-o-葡萄糖苷、木犀草素-4'-o-葡萄糖苷、木犀草素-7-o-β-(6”-o-琥珀酰)-d-葡萄糖苷和木犀草素-4'-o-β-(6”-o-琥珀酰)-d-葡萄糖苷。
4.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述木犀草素底物为木犀草素溶液或含木犀草素的植物的提取液。
5.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述微生物为芽孢杆菌、乳杆菌或重组大肠杆菌中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的转化方法，其特征在于，所述芽...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈育如，高梦楠，冯志营，宋永辉，陆雨婷，王鹏鹏，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：
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